肖孟 劉少華 劉云生 魏奉才 石亮

1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔頜面外科，山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250012

重癥角結(jié)膜干燥癥是由多種原因引起的眼表及淚膜異常的疾病[1]，通過自體頜下腺移植以頜下腺分泌的唾液代替淚液是有效的治療方法[2-3]。血管化自體移植頜下腺難免要經(jīng)歷失神經(jīng)和缺血再灌注過程，可能影響腺體的分泌功能[4]。缺血預(yù)適應(yīng)能改善移植頜下腺的分泌功能[5]，而目前缺血再灌注后頜下腺的損傷-應(yīng)激反應(yīng)尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠頜下腺原位缺血再灌注模型，探討缺血再灌注對(duì)大鼠頜下腺的損傷及損傷-應(yīng)激反應(yīng)對(duì)頜下腺分泌功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

健康的雄性Wistar大白鼠購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量均大于200 g。GMS10016.5 v.A氧化應(yīng)激活性氧檢測試劑盒（Genmed公司，美國）；末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素化的三磷酸脫氧尿苷（2’-deoxyuridine 5’-triphosphate，dUTP）末端標(biāo)記（terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒（QIA33型；Merk公司，德國）； CM1900冰凍切片機(jī)、DFC425 C型熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠頜下腺原位缺血再灌注模型 健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉、消毒后，做頸部正中切口，依次剝離肌肉和筋膜，尋找大鼠頜下腺血管、神經(jīng)及頜下腺導(dǎo)管束。游離并保護(hù)大鼠舌神經(jīng)支配頜下腺的分支，保留副交感神經(jīng)的支配作用。4組大鼠腺體通過無損傷血管夾夾閉頜外動(dòng)脈頜下腺供血支（圖1A），待缺血90 min后分別再灌注1、12、24、72 h。對(duì)側(cè)腺體作為對(duì)照組。

1.2.2 頜下腺分泌量測定 腺體經(jīng)歷1、12、24、72 h再灌注后，各組大鼠再次麻醉，游離兩側(cè)頜下腺導(dǎo)管至口底后切斷導(dǎo)管（圖1B、C），并于斷端處插入直徑約0.5 mm的聚乙烯塑料小管（由10 μL移液管槍頭拉制）測量腺體的分泌量（圖1D）。測量腺體分泌量的方法采用Schirmer實(shí)驗(yàn)，以5 min內(nèi)濾紙條（35 mm×5 mm）濕潤的長度來表示[6]。測量結(jié)果重復(fù)3次取平均值。

圖1 大鼠頜下腺原位缺血再灌注模型的建立及腺體分泌量測定Fig 1 In situ ischemia reperfusion experimental model and salivary flow measurement of rat submandibular glands

1.2.3 頜下腺組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠兩側(cè)頜下腺游離后摘除，取部分腺體組織于10%中性甲醛固定，經(jīng)水洗、脫水、透明、包埋，切成5 μm厚的切片。腺體組織切片經(jīng)蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，封固后于光學(xué)顯微鏡下觀察腺體的組織學(xué)形態(tài)。

1.2.4 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測將部分新鮮頜下腺組織制成10 μm厚的冰凍切片，按氧化應(yīng)激ROS檢測試劑盒的說明檢測腺體組織中ROS水平。熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm），綠色熒光信號(hào)表示組織內(nèi)ROS的水平。細(xì)胞核由4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染，顯示出藍(lán)色熒光信號(hào)。

1.2.5 腺體細(xì)胞凋亡檢測 取5 μm厚的石蠟包埋組織切片，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒的說明檢測腺體組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的水平，然后用甲基綠復(fù)染。通過光學(xué)顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)深棕色，非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)青綠色至淡綠色。每組標(biāo)本在400倍的顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注后大鼠頜下腺分泌功能的變化

缺血再灌注后頜下腺分泌量的變化見圖2：實(shí)驗(yàn)側(cè)頜下腺分泌量在再灌注1、12 h時(shí)與對(duì)照側(cè)相比明顯降低（P<0.01）；再灌注24 h，實(shí)驗(yàn)側(cè)腺體分泌量開始增加，到再灌注72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)腺體的分泌量接近正常水平（P>0.05）。

圖2 缺血再灌注后頜下腺的分泌量Fig 2 The secretory function of the submandibular glands after ischemia reperfusion

2.2 缺血再灌注后頜下腺組織形態(tài)學(xué)的變化

對(duì)照側(cè)頜下腺經(jīng)HE染色后在顯微鏡下可觀察到正常腺泡和導(dǎo)管的形態(tài)（圖3A）。經(jīng)過1 h再灌注，大鼠頜下腺的腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞輕度萎縮，間質(zhì)較正常組織疏松，并出現(xiàn)充血、水腫現(xiàn)象；間質(zhì)內(nèi)可查見以少量單個(gè)核細(xì)胞為主的炎癥浸潤（圖3B）。再灌注12 h后，頜下腺導(dǎo)管和腺體細(xì)胞萎縮，組織水腫加重，部分導(dǎo)管失去正常的形態(tài)，管腔閉鎖；在腺小葉之間和導(dǎo)管周圍出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞彌散分布，以早期中性粒細(xì)胞為主（圖3C）。腺體經(jīng)過24 h再灌注后，組織內(nèi)炎癥浸潤以單核-巨噬細(xì)胞為主，組織水腫有所恢復(fù)，間質(zhì)內(nèi)可見少量梭形的纖維母細(xì)胞（圖3D）。至再灌注72 h，組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤減輕，接近正常（圖3E）。

圖3 頜下腺缺血再灌注后的組織形態(tài)學(xué)變化 HE × 200Fig 3 The histological change of the submandibular glands after ischemia reperfusion HE × 200

2.3 缺血再灌注后大鼠頜下腺的氧化應(yīng)激反應(yīng)

正常頜下腺組織幾乎檢測不到ROS信號(hào)（圖4A）；實(shí)驗(yàn)側(cè)腺體經(jīng)歷缺血再灌注后，熒光顯微鏡下可以觀測到綠色ROS信號(hào)分布在腺體組織中，再灌注1～12 h，ROS信號(hào)逐漸增多（圖4B、C）；持續(xù)灌注24～72 h，腺體內(nèi)ROS水平逐漸降低，最終接近正常組織（圖4D、E）。

圖4 頜下腺缺血再灌注后ROS的表達(dá) 免疫熒光染色 × 200Fig 4 ROS level of the submandibular glands after ischemia reperfusion immunofluorescence × 200

2.4 缺血再灌注后大鼠頜下腺細(xì)胞凋亡水平的變化

大鼠頜下腺缺血再灌注1、12、24、72 h后的細(xì)胞凋亡狀況見圖5。凋亡細(xì)胞呈深棕色，非凋亡細(xì)胞核呈青綠色至淡綠色。

在正常的腺體組織內(nèi)，僅有少量TUNEL陽性細(xì)胞（圖5A）；而腺體經(jīng)過缺血再灌注1、12、24 h后，凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯增多（圖 5B、C、D），隨著再灌注時(shí)間延長，凋亡細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，再灌注72 h后，實(shí)驗(yàn)側(cè)腺體細(xì)胞的凋亡數(shù)目與正常組織相當(dāng)（圖5E）。 經(jīng)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)照側(cè)凋亡細(xì)胞為每視野（1.9±0.41）個(gè)，實(shí)驗(yàn)側(cè)缺血再灌注1、12、24、72 h的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為（14.7±1.40）、（11.0±0.56）、（9.0±0.89）、（2.8±0.59）個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，缺血再灌注1、12、24 h的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照側(cè)（P<0.01），72 h后，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖5 頜下腺缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡狀況 TUNEL × 400Fig 5 Apoptotic cells of the submandibular glands after ischemia reperfusion TUNEL × 400

3 討論

大量研究[7-8]證實(shí)，缺血再灌注損傷是臨床多種疾病的病理基礎(chǔ)，能夠引起移植器官結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的改變。為進(jìn)一步探討單純?nèi)毖俟嘧?duì)移植腺體分泌功能的影響，本實(shí)驗(yàn)保留支配大鼠頜下腺分泌的神經(jīng)分支，建立大鼠頜下腺原位缺血再灌注模型，通過觀察腺體組織學(xué)變化、ROS水平、細(xì)胞凋亡及腺體功能狀況，闡明單純?nèi)毖俟嘧⒛芤鸫笫箢M下腺損傷-應(yīng)激反應(yīng)及腺體分泌功能的改變。本研究證實(shí)，腺體的損傷-應(yīng)激反應(yīng)主要發(fā)生在再灌注早期，隨著再灌注時(shí)間的延長而逐漸減輕。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)歷缺血再灌注后大鼠頜下腺的組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為早期的急性炎癥反應(yīng)及腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷。研究[9-10]證實(shí)，缺血再灌注后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，組織滲出增多，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，導(dǎo)致多種趨化因子和細(xì)胞黏附分子大量生成、釋放，并進(jìn)一步介導(dǎo)局部組織細(xì)胞的炎癥損傷。此外，缺血再灌注后血管功能紊亂和微循環(huán)的變化，可能會(huì)加重組織細(xì)胞的損傷[11]。本研究提示缺血再灌注后早期結(jié)構(gòu)損傷與頜下腺分泌降低密切相關(guān)。

ROS是氧分子的活性代謝產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等，能與許多生物分子發(fā)生活性反應(yīng)。研究表明，ROS產(chǎn)生于缺血組織再灌注后早期，其引起的氧化應(yīng)激是細(xì)胞損傷的主要因素[12]。缺血組織經(jīng)歷再灌注后產(chǎn)生大量的活性氧自由基，ROS能通過攻擊細(xì)胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸），引起細(xì)胞通透性增加，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]；同時(shí)，ROS可增加缺血再灌注后白細(xì)胞的激活、趨化及白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，后者又進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生和釋放，間接加重組織的損傷[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，腺體缺血再灌注后ROS的水平與觀察到的組織損傷情況相符，再灌注早期組織內(nèi)ROS水平顯著增加。

凋亡是細(xì)胞在生理或病理情況下發(fā)生的一種主動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，大量的動(dòng)物或人體器官模型研究表明，細(xì)胞凋亡是組織缺血再灌注損傷的病理特征之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠頜下腺缺血再灌注早期凋亡細(xì)胞的數(shù)目增加，其機(jī)制可能是由于缺血再灌注后的組織能量代謝障礙，氧應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變及結(jié)構(gòu)破壞，并進(jìn)一步通過下游細(xì)胞凋亡通路最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。

頜下腺是主要的唾液分泌器官，在兔頜下腺移植實(shí)驗(yàn)中，移植腺體早期唾液分泌功能降低，而12 h后腺體出現(xiàn)暫時(shí)性分泌增多現(xiàn)象[5]，失神經(jīng)支配可能是其分泌改變的直接原因，而對(duì)于單純?nèi)毖俟嘧?duì)腺體分泌功能的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠頜下腺在保留神經(jīng)支配的情況下經(jīng)歷缺血再灌注1～12 h后，腺體的分泌功能與正常組相比明顯降低，與缺血再灌注后腺體的損傷-應(yīng)激反應(yīng)情況相符。該結(jié)果提示，缺血再灌注的損傷-應(yīng)激反應(yīng)是移植腺體早期分泌功能低下的重要原因。涎腺組織的水轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過跨細(xì)胞和旁細(xì)胞途徑來實(shí)現(xiàn)[16]，本課題組前期的研究[5]也證實(shí)缺血預(yù)適應(yīng)能夠改善再灌注早期移植腺體的分泌功能；筆者推測，缺血再灌注后損傷-應(yīng)激反應(yīng)可能影響腺體水轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，其機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。明確缺血再灌注對(duì)頜下腺分泌功能的損傷作用，尋找合適的臨床干預(yù)手段減少缺血再灌注損傷-應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)改善移植腺體早期的分泌功能，減少腺體移植術(shù)后早期并發(fā)癥有重要意義。

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