郭厚佐 肖遙 廉小天 鄒玲

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041

木糖醇是木糖代謝的正常中間產(chǎn)物，長(zhǎng)期食用含木糖醇的食品可以明顯降低各類齲壞的發(fā)病率，減少口腔中變異鏈球菌的數(shù)量[1-2]。體外研究[3]表明，木糖醇對(duì)于口腔牙菌斑生物膜形成有抑制作用，但具體機(jī)制不明。黏性放線菌是口腔固有菌群的主要成員，能發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)酸，對(duì)牙面尤其是牙骨質(zhì)具有極強(qiáng)的黏附能力，在根面牙菌斑形成過程中發(fā)揮重要作用。目前研究[4-5]認(rèn)為，黏性放線菌的黏附以及產(chǎn)酸能力可能與根面齲的發(fā)生有密切關(guān)系。目前木糖醇對(duì)黏性放線菌的黏附及產(chǎn)酸能力影響的報(bào)道還較少，本實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)曲線測(cè)量和pH值檢測(cè)分析木糖醇對(duì)黏性放線菌的影響，探索采用木糖醇防治齲病的新途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、儀器及培養(yǎng)基制備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 黏性放線菌ATCC 15987由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 厭氧培養(yǎng)箱（浙江義烏冷凍機(jī)總廠），METTLER TOLEDO FE20型pH計(jì)（Mettler Toledo公司，瑞士），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），TDL-40B型低頻離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司），AUTOCLAVE MLS-3780型高壓滅菌機(jī)（Sanyo公司，日本），SPECTRONIC 200分光光度儀（Thermo Scientific公司，美國(guó)）。

1.1.3 木糖醇-BHI液體培養(yǎng)基配制 在腦心浸液（brain heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基中分別加入木糖醇粉末，調(diào)整其質(zhì)量濃度為128 g·L-1，用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.40。配置200 mL上述木糖醇-BHI液體培養(yǎng)基，另配置200 mL純BHI液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值至7.40，立即置于121 ℃、133 MPa條件下消毒2 h，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株的復(fù)蘇以及培養(yǎng) 黏性放線菌ATCC 15987凍干菌株復(fù)蘇48 h后，采用平板劃線法將其接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件（80% N2、10% H2、10% CO2）下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落經(jīng)形態(tài)學(xué)及生化鑒定為純培養(yǎng)物后，將菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)48 h，將菌液在4 ℃下以4 000 r·min-1離心5 min，PBS（pH=7.40）緩沖液洗菌2次，用比濁儀在BHI液體培養(yǎng)基中調(diào)整菌懸液密度至0.5 McFarland（1×108CFU·mL-1），備用。

1.2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測(cè)量 本實(shí)驗(yàn)共分為7組，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組：含不同質(zhì)量濃度木糖醇的BHI培養(yǎng)基+菌懸液，對(duì)照組：BHI液體培養(yǎng)基+菌懸液。

用無菌BHI液體培養(yǎng)基按對(duì)倍稀釋法將已配制好的木糖醇-BHI培養(yǎng)基稀釋為128、64、32、16、8、4 g·L-1共6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，外加純BHI液體培養(yǎng)基，過濾除菌后各取100 μL加入96孔板中。每個(gè)孔取100 μL菌懸液加入96孔板置于微型振蕩器上振蕩混勻1 min，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析儀測(cè)量550 nm波長(zhǎng)下的吸光度，測(cè)定黏性放線菌的生長(zhǎng)情況。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次均設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)組。與對(duì)照組相比，能抑制90%細(xì)菌生長(zhǎng)的最低實(shí)驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度即為MIC。

1.2.3 木糖醇對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸能力的影響 取菌懸液與通過二倍稀釋法得到的不同梯度濃度的木糖醇-BHI培養(yǎng)基各1 mL，接種于無菌15 mL離心管內(nèi)，使管中木糖醇質(zhì)量濃度分別達(dá)到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC，且細(xì)菌終密度均為5×107CFU·mL-1。調(diào)整各組初始pH值至7.40，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，分別于1.5、3、6、12、24、48 h在無菌環(huán)境下測(cè)量培養(yǎng)物上清液pH值，并計(jì)算pH變化值ΔpH，ΔpH=初始pH-終末pH，其初始pH值為7.40。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次均設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)組。

1.2.4 木糖醇對(duì)黏性放線菌生長(zhǎng)的影響 取通過二倍稀釋法得到的不同濃度梯度的木糖醇-BHI培養(yǎng)基各3 mL，加入玻璃試管內(nèi)，使管中木糖醇質(zhì)量濃度分別達(dá)到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC。用無菌BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液密度至1×106CFU·mL-1，并于每個(gè)玻璃管中添加300 μL，于振蕩器上混勻，并調(diào)整pH值至7.40，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。于2、4、6、8、10、12 h用SPECTRONIC 200分光光度儀測(cè)量每個(gè)試管550 nm下的光密度（optical density，OD）值，記錄數(shù)據(jù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次均設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)組。

1.2.5 木糖醇對(duì)黏性放線菌黏附能力的影響 取通過二倍稀釋法得到的不同梯度質(zhì)量濃度的木糖醇-BHI培養(yǎng)基各200 μL加入96孔板中，使孔中木糖醇質(zhì)量濃度分別達(dá)到128、64、32、16、8 g·L-1。調(diào)整菌懸液密度至5×105CFU·mL-1，每個(gè)孔加入20 μL菌懸液并置于微型振蕩器上振蕩混勻1 min，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，結(jié)晶紫生物膜染色后于HTS 7000 Plus多孔板高效分析儀測(cè)量595 nm波長(zhǎng)下的吸光度，測(cè)得最低抑制生物膜形成質(zhì)量濃度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）。將MBIC定義為：與對(duì)照組相比，能抑制50%（MBIC50）或90%（MBIC90）黏性放線菌生物膜形成的最低藥物質(zhì)量濃度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用單因素方差分析Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)一步比較各實(shí)驗(yàn)組間及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MIC測(cè)量結(jié)果

木糖醇能抑制黏性放線菌生長(zhǎng)，MIC為64 g·L-1。

2.2 木糖醇對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸能力的影響

不同質(zhì)量濃度木糖醇培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時(shí)間的ΔpH值見表1。前3 h對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組ΔpH值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。培養(yǎng)6 h時(shí)，對(duì)照組與1/8 MIC的ΔpH值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)照組與剩余各實(shí)驗(yàn)組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。培養(yǎng)12 h，各組間ΔpH值的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且隨木糖醇質(zhì)量濃度升高ΔpH值降低，說明1/2、1/4、1/8 MIC以及MIC質(zhì)量濃度的木糖醇培養(yǎng)基均在短時(shí)間內(nèi)可抑制黏性放線菌產(chǎn)酸，且質(zhì)量濃度越高對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸的抑制作用越明顯。培養(yǎng)48 h，對(duì)照組、1/8 MIC、1/4 MIC的ΔpH值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但相較1/2 MIC、MIC的ΔpH值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示1/2MIC及MIC質(zhì)量濃度的木糖醇培養(yǎng)基可較長(zhǎng)久地抑制黏性放線菌產(chǎn)酸。

表1 不同質(zhì)量濃度木糖醇對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸的影響Tab 1 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus acid production ±s

表1 不同質(zhì)量濃度木糖醇對(duì)黏性放線菌產(chǎn)酸的影響Tab 1 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus acid production ±s

組別 1.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照 0.10±0.037 0.29±0.080 0.74±0.041 1.50±0.043 2.37±0.033 2.66±0.033 1/8 MIC 0.17±0.028 0.25±0.060 0.72±0.055 1.34±0.053 2.35±0.028 2.66±0.037 1/4 MIC 0.13±0.032 0.14±0.061 0.44±0.057 0.87±0.041 2.26±0.069 2.64±0.045 1/2 MIC 0.16±0.056 0.16±0.043 0.44±0.065 0.63±0.044 1.62±0.049 2.50±0.033 MIC 0.12±0.090 0.20±0.089 0.43±0.031 0.52±0.041 0.93±0.058 1.77±0.065

2.3 木糖醇對(duì)黏性放線菌生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度木糖醇培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時(shí)間的OD550測(cè)量值見表2。前6 h內(nèi)各組OD550的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），此為細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期，OD550測(cè)量值并無明顯變化。6～12 h，對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組OD550的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明1/2、1/4、1/8 MIC以及MIC質(zhì)量濃度的木糖醇培養(yǎng)基對(duì)黏性放線菌對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。培養(yǎng)12 h，除1/2 MIC及MIC組之外，其余各組的OD550差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明黏性放線菌的生長(zhǎng)在1/2 MIC及MIC木糖醇培養(yǎng)基中將受到較長(zhǎng)久的抑制。

表2 不同質(zhì)量濃度木糖醇對(duì)黏性放線菌生長(zhǎng)的影響Tab 2 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus growth ±s

表2 不同質(zhì)量濃度木糖醇對(duì)黏性放線菌生長(zhǎng)的影響Tab 2 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus growth ±s

組別 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h對(duì)照 0.038±0.017 0.157±0.015 0.357±0.033 0.511±0.030 1.054±0.026 1.750±0.075 1/8 MIC 0.059±0.008 0.127±0.054 0.272±0.035 0.388±0.045 0.769±0.072 1.517±0.136 1/4 MIC 0.070±0.067 0.131±0.018 0.262±0.037 0.441±0.067 0.854±0.025 1.490±0.021 1/2 MIC 0.057±0.010 0.106±0.009 0.173±0.007 0.286±0.078 0.462±0.121 0.665±0.004 MIC 0.053±0.014 0.090±0.089 0.115±0.024 0.167±0.046 0.187±0.049 0.229±0.087

2.4 木糖醇對(duì)黏性放線菌黏附能力的影響

木糖醇能夠抑制黏性放線菌生物膜的形成，其MIBC50為64 g·L-1，MIBC90為128 g·L-1。

3 討論

現(xiàn)代口腔生態(tài)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為：黏性放線菌等致齲相關(guān)菌通常為口腔內(nèi)常駐菌，齲病的發(fā)生是口腔微生態(tài)系統(tǒng)失衡的結(jié)果[6]。正常條件下，通過唾液分泌等口腔內(nèi)各類緩沖作用，口腔pH值可維持在5.6～7.6的中性范圍內(nèi)[7]。當(dāng)口腔內(nèi)致齲菌于菌斑中代謝碳水化合物產(chǎn)酸，降低菌斑pH值至5.5以下時(shí)，釉質(zhì)的脫礦和再礦化平衡就會(huì)被打破，牙體硬組織脫礦，齲損形成。黏性放線菌的致病性主要表現(xiàn)在對(duì)牙面的黏附，以及產(chǎn)酸和耐酸，而且近年來有學(xué)者[8]指出其在厭氧環(huán)境下的產(chǎn)酸能力被低估了。

本研究選用木糖醇進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外的研究普遍認(rèn)為，木糖醇能有效防齲，主要原因有如下兩點(diǎn)。第一，阻止菌斑細(xì)菌代謝產(chǎn)酸。由于木糖醇不能被菌斑細(xì)菌所分解代謝，口腔內(nèi)的微生物無法利用其產(chǎn)酸，因此菌斑的產(chǎn)酸量下降，有助于脫礦釉質(zhì)再礦化，降低齲的發(fā)生。第二，促進(jìn)再礦化形成。咀嚼無糖口香糖可刺激唾液分泌，增加唾液中各類緩沖體系的緩沖效果，使緩沖能力增強(qiáng)[9]，pH值升高，有利于牙齒硬組織的再礦化。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)木糖醇質(zhì)量濃度高于64 g·L-1時(shí)，木糖醇對(duì)黏性放線菌的抑制效果明顯，黏性放線菌基本不在這種環(huán)境中生長(zhǎng)。當(dāng)木糖醇質(zhì)量濃度低于64 g·L-1時(shí)，對(duì)黏性放線菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸仍有一定程度的抑制作用，但隨質(zhì)量濃度的下降，木糖醇對(duì)黏性放線菌的抑制效果逐漸減弱。這些結(jié)果提示，木糖醇能有效地抑制黏性放線菌的生長(zhǎng)、黏附以及產(chǎn)酸，有一定的抑制致齲菌的效果。

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