張文會(huì)，孫同韋，張會(huì)圖，王海寬，王洪彬，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

近年來，隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)以及綠色飼料的興起，對(duì)β-甘露聚糖酶在飼料工業(yè)的應(yīng)用已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[1].甘露聚糖占飼料中非淀粉多糖的30%,，是目前大量應(yīng)用的玉米/豆粕型飼料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子[2].它們能結(jié)合大量的水分，使采食動(dòng)物消化道中食糜的體積增大、黏度增加、養(yǎng)分與消化道內(nèi)源酶的作用降低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率下降，造成動(dòng)物生長(zhǎng)受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低，從而使其代謝受到抑制[3].在飼料中添加甘露聚糖酶能有效消除它們的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[4].另外，添加β-甘露聚糖酶后，在動(dòng)物體內(nèi)能夠產(chǎn)生甘露寡糖，可進(jìn)一步刺激和增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，調(diào)控動(dòng)物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，抑制有害菌黏附[5].目前已發(fā)現(xiàn)的β-甘露聚糖酶種類很多，其中不乏催化性能優(yōu)良的高比活β-甘露聚糖酶[6-8].而真正應(yīng)用于飼料添加劑的β-甘露聚糖酶則為數(shù)不多，并且很難發(fā)揮理想效果.究其原因，是由于大部分β-甘露聚糖酶的酸穩(wěn)定性較差，難以耐受單胃動(dòng)物消化道中的強(qiáng)酸環(huán)境以及消化道中由酸性至中性的變化過程；另外也有一些β-甘露聚糖酶由于受到消化液中蛋白酶的降解作用而迅速失活[9].因此，尋找具有耐酸、抗蛋白酶特性的新型β-甘露聚糖酶是解決這一問題的關(guān)鍵所在.

本研究以尋找適合用于飼料添加劑的新型β-甘露聚糖酶為目標(biāo)，從一株可大量分泌表達(dá)蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis)TCCC11286 中篩選分離到一種具有耐酸抗蛋白酶特性的β-甘露聚糖酶.

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis)TCCC11286，本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.2 主要試劑

胰蛋白酶，上海伯奧公司；角豆膠、甘露糖，Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

從國內(nèi)3 個(gè)商家所購買的β-甘露聚糖酶酶粉分別標(biāo)記為A、B、C.

1.3 培養(yǎng)基

β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：角豆膠5，蛋白胨2，酵母浸出物2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.25，瓊脂2.

牛奶篩選培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，脫脂奶粉30，瓊脂20，pH 7.0～7.2.

LB 培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出物5，胰蛋白胨10，NaCl 10.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉10，酵母膏2，MgSO40.3，F(xiàn)eSO40.01，K2HPO42，NaCl 1，(NH4)2SO45，吐溫80 1，pH 7.0～7.2.

1.4 蛋白酶及β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選：通過LB 固體培養(yǎng)基三區(qū)劃線將來自實(shí)驗(yàn)室的枯草芽孢桿菌菌株在37,℃培養(yǎng)24,h，進(jìn)行純化和活化.將平板上長(zhǎng)出的單菌落依次點(diǎn)接到牛奶篩選培養(yǎng)基上，37,℃培養(yǎng)24,h，產(chǎn)生蛋白酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)透明圈，保存透明圈較大的菌株.

β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選：將初篩得到的蛋白酶產(chǎn)生菌株依次點(diǎn)接到牛奶篩選培養(yǎng)基上、β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基上，37,℃培養(yǎng)24,h，將0.1%,剛果紅溶液傾倒于長(zhǎng)出菌落的篩選平板上，10～15,min 后倒去剛果紅溶液，用l mol/L 的NaCl 溶液反復(fù)沖洗2～3 次；然后加入l mol/L NaCl 溶液靜置15,min 后倒掉，此時(shí)，產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)透明圈，保存透明圈較大的菌落.

1.5 β-甘露聚糖酶酶活的測(cè)定

β-甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解成寡糖和單糖.具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS 試劑發(fā)生顯色反應(yīng).反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中β-甘露聚糖酶的活力成正比.因此，通過分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中β-甘露聚糖酶的活力.

酶活單位定義：在pH 5.5、50,℃條件下，每分鐘內(nèi)底物降解釋放1,μmol D-甘露糖所需要的酶量為1個(gè)酶活單位U.

酶活測(cè)定：取 0.5,mL 適當(dāng)稀釋的酶液加入1.5,mL 0.5%,角豆膠溶液，50,℃保溫20,min，加入2,mL DNS，沸水浴10,min，冷卻至室溫后用去離子水定容至15,mL；空白對(duì)照：0.5,mL 適當(dāng)稀釋的酶液加入2,mL DNS，50,℃保溫20,min，加入1.5,mL 角豆膠溶液，沸水浴10,min，冷卻至室溫后用去離子水定容至15,mL.在波長(zhǎng)550,nm 的條件下測(cè)定吸光度.

1.6 β-甘露聚糖酶的純化

1.6.1 粗酶液的制備

將枯草芽孢桿菌TCCC11286 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，37,℃、170,r/min 培養(yǎng)48,h.將發(fā)酵液在4,℃、12,000,r/min 離心10,min，收集上清液，即為粗酶液.

1.6.2 硫酸銨鹽析

采用分步鹽析法.粗酶液中添加(NH4)2SO4至50%,飽和度，4,℃靜置過夜，4,℃、8,000,r/min 離心20,min，棄沉淀；上清液繼續(xù)添加(NH4)2SO4至80%,飽和度，4,℃靜置過夜，離心，沉淀備用.

1.6.3 陰離子交換層析

將沉淀用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，透析袋透析脫鹽，上樣至已用乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡過的Hitrap Q HP 陰離子柱(5,cm×5,cm)上，階段洗脫.用含有1,mol/L NaCl 的磷酸緩沖液以0～100%,的梯度進(jìn)行洗脫，流量為0.5,mL/min，收集洗脫峰，測(cè)定各管的β-甘露聚糖酶活性.合并較高酶活性的收集液，透析，并利用超濾管進(jìn)行濃縮.

1.6.4 凝膠過濾層析

將離子交換層析后的β-甘露聚糖酶的活性組分收集濃縮，然后上樣至預(yù)先用乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡好的分子篩(Superdex 200 10/300,GL)上，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，流量為0.5,mL/min，收集濃縮含有β-甘露聚糖酶活性組分.對(duì)各步純化組分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè).

1.7 β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.7.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

采用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制β-甘露聚糖酶活性測(cè)定反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系分別置于30～75,℃的溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定其酶活力.酶活力最高的溫度為最適反應(yīng)溫度，其酶活力設(shè)為100%,，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活力.將酶液分別置于30～75,℃處理60,min 后，測(cè)定酶活力，以0,℃下處理的β-甘露聚糖酶酶活力定為100%,，計(jì)算各溫度處理后的相對(duì)酶活力，分析其溫度的穩(wěn)定性.

1.7.2 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性

采用pH 2～12 的0.2,mol/L 的緩沖液(pH 2.0～8.0,Na2HPO4-檸檬酸，pH 9～10 甘氨酸-NaOH，pH 11.0～12.0,Na2HPO4-NaOH)配制β-甘露聚糖酶的催化反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系于50,℃反應(yīng)15,min 后測(cè)定酶活力，酶活力最高的pH 為最適pH，其酶活力設(shè)為100%,，計(jì)算其他pH 條件下的相對(duì)酶活力.采用pH 2～12 的不同的緩沖液處理酶液1,h 后，測(cè)定酶活力，以酶活力最大的pH 下的酶活力設(shè)為100%,，計(jì)算各pH 處理下的相對(duì)酶活力，分析其pH 的穩(wěn)定性.

1.7.3 不同金屬離子與化學(xué)試劑對(duì)β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響

分別用1,mmol/L 和5,mmol/L 的金屬離子溶液及其他化學(xué)試劑溶解酶解底物，測(cè)定酶活力，以未添加任何金屬離子和化學(xué)試劑的底物下測(cè)得的酶活力為100%,，計(jì)算加入金屬離子和其他化學(xué)試劑下的相對(duì)酶活力，研究金屬離子和其他化學(xué)試劑對(duì)該酶活力的影響.

1.8 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶測(cè)試

將純化后的β-甘露聚糖酶與市面上的商業(yè)酶(編號(hào)A、B、C)進(jìn)行耐酸抗蛋白酶比較實(shí)驗(yàn).1,mL 酶液加入到9,mL 50,mmol/L pH 2.0 的甘氨酸-鹽酸緩沖液中，37,℃、120,r/min 孵育1,h，測(cè)定酶活力，以未處理過的酶活力定為100%,，計(jì)算各酶液處理后的相對(duì)酶活力，分析其穩(wěn)定性.各取上述孵育液1,mL，加入到含有0.1%,胰蛋白酶的9,mL 20,mmol/L pH 5.5 乙酸-乙酸鈉緩沖液中，37,℃繼續(xù)孵育2,h，測(cè)定酶活力.以未經(jīng)胰蛋白酶處理過的上述孵育液酶活力定為100%,，計(jì)算其處理后的相對(duì)酶活力，分析其穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶和β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果如圖1(a)所示，產(chǎn)蛋白酶的菌落周圍會(huì)形成透明圈.β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果如圖1(b)所示，產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌落周圍會(huì)形成透明圈.

圖1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶和蛋白酶菌株的篩選Fig.1 Isolation of strains producing the new β-mannanase and protease

2.2 β-甘露聚糖酶的純化

將枯草芽孢桿菌 TCCC11286 搖瓶發(fā)酵，收集粗酶液，利用80%,的硫酸銨鹽析離心后上清液中的β-甘露聚糖酶酶活力最低，透析液在過陰離子交換柱時(shí)出現(xiàn)3 個(gè)峰，并且只有第2 個(gè)峰收集液測(cè)到β-甘露聚糖酶的酶活力，將收集液經(jīng)過凝膠過濾層析純化后，比酶活由560,U/mg 提高到8,232.6,U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到14.7 倍，回收率為47%,.SDS-PAGE 結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出，純化后的β-甘露聚糖酶是相對(duì)分子質(zhì)量為3.7×104的單一條帶.

2.3 β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

將β-甘露聚糖酶純酶液分別在不同pH 的緩沖體系中測(cè)定其酶活力，以pH 為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖3 所示，β-甘露聚糖酶的最適pH 為5.5，且在pH 2.0～10.0 范圍內(nèi)，酶活力保持在60%,以上.因此β-甘露聚糖酶在pH 2.0～10.0 之間比較穩(wěn)定，有比較寬的pH 穩(wěn)定范圍，有很好的耐酸特性.該酶比已報(bào)道的酶更具有酸、堿穩(wěn)定性[10]，這一特點(diǎn)更有利于該酶在飼料添加劑中的使用.

圖2 各個(gè)純化步驟樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of the mannanase sample in each purification procedure

圖3 β-甘露聚糖酶的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.3 The optimal pH and pH stability of the new βmannanase

在不同的溫度(30～70,℃)下測(cè)定β-甘露聚糖酶純酶液的酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活力.以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖4 所示.結(jié)果表明：β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50,℃，且在30～60,℃范圍內(nèi)，酶活力保持在60%,以上，在60,℃以上β-甘露聚糖酶的酶活力降到40%,以下.該酶的最適溫度與大部分的來源于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶相似，而B.,subtilis 168 的最適反應(yīng)溫度卻是37,℃[11].β-甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性有利于飼料添加劑的保存與運(yùn)輸.

圖4 β-甘露聚糖酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 The optimum temperature and thermal stability of the new β-mannanase

不同濃度的化學(xué)試劑及金屬離子對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響結(jié)果如圖5 所示.對(duì)于不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響結(jié)果表明：金屬離子Hg2+和Ag+、表面活性劑SDS、吐溫20、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)對(duì)該β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na+、Ni2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+、乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)該酶的酶活力基本沒有影響，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+對(duì)該酶有明顯的激活作用.作為飼料添加劑，這一特性有利于抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶[12-14].

圖5 不同濃度的化學(xué)試劑及金屬離子對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of the new β-mannanase

2.4 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶測(cè)試

用分離純化到的β-甘露聚糖酶進(jìn)行耐酸抗蛋白酶的測(cè)試，并與國內(nèi)所售的3 種β-甘露聚糖酶進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6 所示.枯草芽孢桿菌TCCC11286產(chǎn)的β-甘露聚糖酶耐酸相對(duì)酶活力在70%,以上，抗蛋白酶相對(duì)酶活力在60%,以上，均高于其他3 種β-甘露聚糖酶.因此，枯草芽孢桿菌TCCC11286 合成的β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶活性較優(yōu)，該酶在飼料添加劑的應(yīng)用中具有很大的潛能.

圖6 β-甘露聚糖酶的耐酸和抗蛋白酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Acid and protease resistance experiment of the new β-mannanases

3 結(jié)論

本研究從一株高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌中分離純化到一種新型β-甘露聚糖酶，其最適反應(yīng)溫度為55,℃，最適pH 為5.5，在pH 2～10 的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+對(duì)該酶有明顯的激活作用，此外，其具有良好的耐酸抗蛋白酶的特性，因此Bacillus subtilis TCCC11286 所合成的β-甘露聚糖酶是非常有價(jià)值的飼料添加劑原料，可進(jìn)行深入研究，以實(shí)現(xiàn)β-甘露聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用.雖然該酶的酶活力距離應(yīng)用的要求還有一定的差距，但可以通過優(yōu)化發(fā)酵條件或者誘變育種和結(jié)合分子手段構(gòu)建高效表達(dá)的工程菌提高產(chǎn)量，以達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的目的.

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