郭奕斌

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

遺傳性骨病的基因診斷進(jìn)展

郭奕斌

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

遺傳性骨病種類、分型繁多，常規(guī)診斷難以確診，而基因診斷在遺傳性骨病的確診、分型等方面都發(fā)揮著不可或缺的作用。近一、二十年來，基因診斷技術(shù)進(jìn)展迅猛，各種檢測方法層出不窮。本文重點(diǎn)圍繞遺傳性骨病的基因診斷技術(shù)的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對臨床診防工作提供一些有益的啟示。

遺傳性骨??；基因診斷；技術(shù)方法

遺傳性骨病(genetic skeletal disorders，GSD)是指由于遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致骨骼畸形的一類遺傳性疾病，它是一大類具有遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性的骨軟骨發(fā)育不良病。它們大多是發(fā)病率很低的罕見病，但種類繁多，總發(fā)病率大于1/5000[1]。這些骨病發(fā)病早，癥狀明顯，以骨骼塑形、生長、分化、內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常為主要特征，通常造成患者致殘甚至致死，其發(fā)病率與死亡率相當(dāng)可觀，而且此類骨病還會逐代或隔代遺傳，故危害十分嚴(yán)重，往往給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給患者及其親屬帶來巨大的心理負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)[2]。

1 遺傳性骨病的種類和分組

根據(jù)國際骨骼發(fā)育異常協(xié)會(International Skeletal Dysplasia Society, ISDS)制訂的分類標(biāo)準(zhǔn)，2006年全世界GSD統(tǒng)計有372種，分為37組，2010年更新為456種，分為40組，其中316種遺傳性骨病與一個或多個致病基因有關(guān)，相關(guān)致病基因多達(dá)226個[3]。若按北京華大基因公司2015年的最新分類(BGI version)，則分成497種，41組，相關(guān)致病基因增至363個。

2 遺傳性骨病的特點(diǎn)

2.1 遺傳性 之所以稱為遺傳性骨病，是因為它們都是由于遺傳物質(zhì)改變(基因突變)而引起的遺傳性疾病，因此可以逐代遺傳或隔代遺傳，可以男女相互遺傳(常染色體遺傳，與性別無直接關(guān)系)，也可以男女交叉遺傳(X連鎖遺傳，與性別有直接關(guān)系)等。

2.2 罕見性 它們都屬于罕見病，即罕見性遺傳病(rare genetic diseases)，發(fā)病率很低，通常是萬分之一或十萬分之一以下。有些罕見病，至今全世界也只報道寥寥數(shù)例。

2.3 多樣性 遺傳性骨病種類繁多，至今已報道的就有近500種，臨床上相對常見的有：軟骨發(fā)育不全、致死性侏儒癥、軟骨發(fā)育低下、假性軟骨發(fā)育不全、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、先天性脊柱骨骺發(fā)育不良、遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良、X連鎖低血磷性佝僂病、黏多糖貯積癥、干骺端軟骨發(fā)育不良、軟骨生成不全、軟骨外胚層發(fā)育不良、窒息性胸廓發(fā)育不良、短肋-多指(趾)綜合征及成骨不全等30多種[2,4]。

2.4 高發(fā)性 從遺傳學(xué)的角度來看，再發(fā)風(fēng)險在5%～10%的屬于中度風(fēng)險，大于10%的即屬高風(fēng)險。遺傳性骨病即使是最少的AR遺傳病，也有25%的再發(fā)風(fēng)險，所以都屬于高風(fēng)險病種。

2.5 危害性 遺傳性骨病通常都是致殘致死性、危害很嚴(yán)重的遺傳性侏儒癥，除了個頭矮小、生長發(fā)育遲緩?fù)?，通常還有骨骼畸形、智力受損、肝脾腫大、心肺功能異常等，即使不致死，也往往致殘。

2.6 難治性 由于遺傳性骨病通常都是致殘致死性的，因此一旦出現(xiàn)癥狀，往往很難治療，實際上絕大多數(shù)遺傳性骨病至今都無確實有效的根治療法。對癥治療通常只能治標(biāo)而無法治本，骨髓移植、酶替代療法、干細(xì)胞治療費(fèi)用昂貴甚至超昂貴，遠(yuǎn)期療效不明確，特別是癥狀已經(jīng)顯現(xiàn)出來的比如已經(jīng)智力受損、肝脾腫大、骨骼畸形等，即使花費(fèi)很多人力、財力，也很難收到預(yù)期療效。而基因治療目前大多還停留在實驗室研究階段，離應(yīng)用到臨床治療還有相當(dāng)長的一段路要走。

3 遺傳性骨病基因診斷的進(jìn)展

遺傳性骨病幾乎都是單基因病。對于基因病，基因診斷被公認(rèn)是確診該類疾病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，它可以在分子水平甚至在單個堿基發(fā)生改變的情況下做出明確診斷。它打破常規(guī)的診斷方式，不以疾病的表型為主要依據(jù)，而是采用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測被檢者某一特定基因的結(jié)構(gòu)或者功能是否異常，從而對疾病做出診斷。相對于常規(guī)診斷，基因診斷更注重個體基因狀態(tài)，不僅可以對患者所患疾病做出判斷，還可以對表型正常的攜帶者或者遺傳易感者做出前瞻性診斷[5]。近一、二十年來，基因診斷技術(shù)取得了前所未有的進(jìn)步。下面重點(diǎn)對遺傳性骨病的最新基因診斷技術(shù)做一綜述。

基因診斷通常是在基因定位、基因克隆、基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)弄清或雖未弄清但與其他遺傳標(biāo)記(genetic marker)的連鎖關(guān)系已經(jīng)明確的情況下進(jìn)行的，大致分為間接診斷和直接診斷2大類。

3.1 間接診斷 間接診斷是指當(dāng)致病基因本身尚屬未知或致病基因雖然已知但其突變尚屬未知時，可以通過對患者及其家系成員進(jìn)行連鎖分析或單倍型分析，從而推斷受檢者是否帶有致病基因的一種診斷方法。

連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位點(diǎn)，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記。RFLP、SSLP、STR、SNP等均可用于連鎖分析。通過多位點(diǎn)的連鎖分析，還可進(jìn)行親子鑒定等。通常，RFLP被認(rèn)為是第一代遺傳標(biāo)記，SSLP/ STR是第二代遺傳標(biāo)記，SNP是第三代遺傳標(biāo)記[6，7]。

3.2 直接診斷 對于基因序列、結(jié)構(gòu)、功能、突變類型都清楚的，且發(fā)生于候選基因內(nèi)的突變的檢測，可以采用直接診斷的方法。直接診斷是指直接檢查目的基因本身有無異常。它通常是用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因有無突變、缺失等異常并闡明突變的性質(zhì)和突變的類型等。直接診斷適用于已知基因異常的疾病，下面將分別介紹。

3.2.1 分子雜交及相關(guān)技術(shù) 互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即所謂的分子雜交。分子雜交技術(shù)包括southern blot、northern blot、dot blot、RDB、SSH、western blot等。其中，southern blot、northern blot和dot blot、RDB、SSH也稱核酸的分子雜交，用于檢測特定的DNA、RNA；western blot又稱免疫學(xué)測定，用于檢測特定的蛋白質(zhì)。核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一，其中，抑制性消減雜交技術(shù)、DNA生物傳感器檢測法比較新穎，本節(jié)重點(diǎn)介紹它們。

3.2.1.1 抑制性消減雜交技術(shù)(SSH) SSH技術(shù)是一種鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的技術(shù)，是一種以抑制性PCR(是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，使非目的序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列片段擴(kuò)增)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將標(biāo)準(zhǔn)化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)，它是建立在抑制性雜交和選擇性PCR基礎(chǔ)上的差異表達(dá)基因篩選手段。通過合成2個不同的接頭，接于經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的測試cDNA片段的5’末端，將測試和驅(qū)動進(jìn)行兩輪雜交[8，9]。

該技術(shù)篩選高效，假陽性率低，因而廣泛應(yīng)用在動物、植物、人類及癌癥等研究領(lǐng)域[6]。但其實驗材料是通過PCR擴(kuò)增獲得的，整個過程包括多次酚：氯仿抽提，這些過程可能會使部分基因丟失，這是其不足之處。

3.2.1.2 DNA生物傳感器檢測法(DNA biosensors) 該技術(shù)是由固定有已知的核苷酸序列的單鏈DNA(ssDNA)的電極(探頭)和換能器兩部分組成。固定在傳感器電極上的ssDNA探針與待測樣品的目標(biāo)DNA雜交，形成雙鏈DNA(dsDNA)，雜交反應(yīng)在傳感器電極上直接完成，換能器將雜交過程中所產(chǎn)生的變化轉(zhuǎn)換成電、光、聲等物理信號，從而對待檢樣品進(jìn)行檢測[10]。

該技術(shù)靈敏度高，快速經(jīng)濟(jì)，無需標(biāo)記；檢測裝置簡單輕巧，易于實現(xiàn)微型化；檢測過程中不受樣品混濁度限制。適合研究堿基錯配對DNA電子傳遞性質(zhì)的影響[10]。

3.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及其衍生技術(shù) 對于基因突變的檢測，在1985以前主要是利用Southern印跡法，它可以檢出基因的缺失、插入、重組等突變形式，而點(diǎn)突變、微缺失、微插入則很難檢出，只能應(yīng)用PCR結(jié)合其他方法完成。PCR技術(shù)是突變研究中的重大進(jìn)展，目前幾乎所有的基因突變檢測技術(shù)都是建立在PCR基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出許多新方法，目前已達(dá)20余種，自動化程度也越來越高，分析時間也大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大提高。

PCR技術(shù)目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴(kuò)大。本小節(jié)重點(diǎn)介紹三引物PCR、實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR這幾種。

3.2.2.1 三引物PCR法(TP-PCR) TP-PCR是一種不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的重組DNA的方法?？捎糜谄唇尤诤匣?，目的基因中堿基的定點(diǎn)突變，目的基因中某些功能結(jié)構(gòu)域的人工缺失研究，在目的基因中的任何位置插入外源基因片段，進(jìn)行重組基因的研究。

該法的原理是：TP-PCR反應(yīng)體系中有2種模板和3種引物，可以在同一個反應(yīng)體系中產(chǎn)生一個重組DNA分子。設(shè)計合理的中間引物是保證TP-PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵。只有中間引物設(shè)計合理才能保證2種DNA片段在融合位點(diǎn)正確連接。3條引物的濃度比例是另一個關(guān)鍵因素。要適當(dāng)調(diào)節(jié)中間引物的比例使得TP-PCR反應(yīng)獲得最理想的結(jié)果。實驗結(jié)果表明，合適的比例范圍可有效增加目的片段的擴(kuò)增，同時減少非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，一般來說在1/1000～1/100范圍內(nèi)比較合適。除此之外，為了保證PCR產(chǎn)物的高忠實性，需用高忠實的DNA聚合酶來代替Taq聚合酶[11-13]。

TP-PCR法簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)，可以在所期望的任何位點(diǎn)將2種DNA片段連接起來，而無需知道DNA片段的限制位點(diǎn)。通過TP-PCR進(jìn)行重組操作，可以在幾個小時內(nèi)于一個PCR反應(yīng)體系中完成，無需高檔設(shè)備儀器和試劑盒，即可實現(xiàn)對所研究的目的基因的改造。該法的突出優(yōu)點(diǎn)在于無需設(shè)計外源的DNA序列，即可實現(xiàn)對目的基因的任何常規(guī)性改造，從而避免在原有基因中引入冗余的酶切位點(diǎn)的堿基序列[11-13]。

3.2.2.2 RT-PCR、RTQ-PCR和多重巢式RT-PCR RT-PCR為逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)和實時PCR(real time PCR)共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR是PCR的一種衍生技術(shù)。在逆轉(zhuǎn)錄PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量檢測RNA的含量。

實時為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，PCR通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR, qPCR)或者實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR, RTQ-PCR)[14]。實時PCR，屬于定量PCR的一種，以一定時間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。

多重巢式RT-PCR的原理同多重巢式PCR，不同之處在于所用的模板是cDNA而不是DNA。

逆轉(zhuǎn)錄PCR可在RNA水平檢測基因的突變類型和突變效應(yīng)，它和多重巢式RT-PCR有一個共同的缺點(diǎn)就是所提的RNA易降解且操作較繁瑣。實時熒光定量PCR具有靈敏、特異、技術(shù)成熟和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，對于臨床上明確診斷、具體分型、動態(tài)觀測腫瘤負(fù)荷、選擇合適治療方案、評估治療效果和預(yù)后都有較大價值。在產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷也具有重要意義。

3.2.2.3 數(shù)字PCR技術(shù)(dPCR) dPCR技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量技術(shù)，與傳統(tǒng)qPCR/ RTQ-PCR技術(shù)不同，dPCR采用絕對定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比qPCR更加出色的靈敏度、特異性和精確性，故得到廣泛的應(yīng)用。這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面都具有諸多優(yōu)勢，其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。

該技術(shù)是采用“分而治之”(divide and conquer)的策略，將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。

dPCR是PCR領(lǐng)域最激動人心的創(chuàng)新之一，該技術(shù)可應(yīng)用于單細(xì)胞分析、罕見腫瘤等位基因檢測、產(chǎn)前診斷以及血液中游離腫瘤DNA、表觀遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等眾多領(lǐng)域[15-29]。如果將PCR技術(shù)進(jìn)行分代的話，那么第一代PCR技術(shù)就是我們目前最常用的常規(guī)PCR了，它可通過凝膠電泳獲得定性結(jié)果。而曾經(jīng)風(fēng)靡全球的qPCR/RTQ-PCR可稱為第二代PCR技術(shù)，它利用熒光試劑監(jiān)控擴(kuò)增，來實現(xiàn)相對定量，在開展基因表達(dá)分析時，需要標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考基因來協(xié)助定量。而dPCR則可謂是第三代PCR技術(shù)，它不再依賴Cq值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目，它是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于一個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。它比qPCR更加靈敏、特異、精確，故日益得到廣泛的應(yīng)用?？蓱?yīng)用于癌癥生物標(biāo)志物研究和拷貝數(shù)變異分析、病原體檢測、與NGS無縫對接對二代測序結(jié)果進(jìn)行驗證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測[15-29]。

3.2.3 PCR基礎(chǔ)上的基因突變檢測技術(shù)

3.2.3.1 擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)/限制性核酸內(nèi)切酶(amplification refractory mutation system/restriction endonuclease, ARMS/RE) ARMS/RE雙重鑒定法特別適用于種植前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)等需快速特異、準(zhǔn)確靈敏檢測的項目。此法是將ARMS[30，31]與RE巧妙結(jié)合，在設(shè)計3'端錯配堿基的特異引物的同時引入酶切位點(diǎn)。有時一個堿基的錯配不一定含有酶切位點(diǎn)，這時可根據(jù)限制酶的識別序列，人為設(shè)計成雙錯配甚至三錯配。

ARMS/RE將ARMS法和RE法合二為一，具有雙重鑒定的效能，即首先用ARMS法鑒定一次，然后再用RE法鑒定一次，故可大大提高鑒定的準(zhǔn)確率。本科室曾用該法用于軟骨發(fā)育不全的PGD研究并獲得成功[32]。但該法也有不足，其不足就是往往需要花費(fèi)很多時間人為錯配堿基才能找到酶切位點(diǎn)，且所用的內(nèi)切酶多數(shù)較罕見，成本較高，且酶易失活，保存期有限。

3.2.3.2 變性高效液相色譜分析(DHPLC) DHPLC是一種高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)，主要用來分析異質(zhì)性雙鏈結(jié)構(gòu)：①在不變性的溫度條件下，檢測并分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態(tài)性的片段；②在完全變性溫度條件下，可以區(qū)分單鏈DNA或RNA 分子，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質(zhì)量控制；③在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性復(fù)性過程，不僅分別形成同源雙鏈，同時也錯配形成異源雙鏈，根據(jù)柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識別變異型[33，34]。

該技術(shù)可進(jìn)行基因突變檢測、SNP分析等方面的研究，可檢測出含有單個堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段，快速高效無毒經(jīng)濟(jì)，除了檢測已知突變還能檢測未知突變，自動化程度高，其敏感性和特異性可達(dá)90%以上，明顯高于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)檢測技術(shù)。但該技術(shù)不能檢測純合突變，檢測純合突變需在PCR產(chǎn)物中加入野生型擴(kuò)增產(chǎn)物；不能確定突變的具體位點(diǎn)，也不能確定是哪種突變類型；儀器價格高，分離柱有一定的使用壽命，需定時更換；目前僅用于檢測200～500 bp大小的DNA片段；引物二聚體、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物以及與樣品堿基數(shù)類似的污染產(chǎn)物將會影響分析，需通過優(yōu)化PCR去除之；PCR產(chǎn)物濃度必須足夠大，否則會導(dǎo)致信噪比下降，分析結(jié)果的可靠性也會隨之下降[33，34]。

3.2.3.3 高分辨熔解曲線分析(HRM) 該法主要用于未知突變篩查。根據(jù)目標(biāo)DNA序列的長度、GC含量及堿基的互補(bǔ)性差異，利用HRM對樣品的基因型進(jìn)行分析，其分辨精度可達(dá)單個堿基的差異。由于每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，因而在加熱變性時就會有獨(dú)特的溶解曲線形狀，它可以通過DNA分子緩慢升溫過程中飽和熒光染料熒光值的變化而得到具體顯現(xiàn)。如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。根據(jù)它們獨(dú)特的溶解曲線，即突變片段與野生型片段熔解曲線的形狀和位置存在差異，就可以對不同的核酸片段進(jìn)行區(qū)分[35]。

該法在突變篩查中其便捷性、靈敏性與特異性均優(yōu)于DHPLC，并且檢測成本較低，耗時較少，是近年來發(fā)展起來的核酸分析技術(shù)。靈敏快速無毒高效，對已知和未知的突變都可檢測。但和DHPLC一樣，不能準(zhǔn)確檢測具體突變[35]。

3.2.3.4 多重連接探針依賴性擴(kuò)增技術(shù)(MLPA) 針對基因內(nèi)每個待檢區(qū)域設(shè)計一對DNA探針。每個MLPA探針包括2個熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，一段引物序列和一段特異性雜交序列。在MLPA反應(yīng)中，2個寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶連接2部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)2個探針與靶序列特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個堿基的差別，連接反應(yīng)也無法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用一對通用引物擴(kuò)增連接好的探針，每個探針擴(kuò)增產(chǎn)物的長度都是唯一的，范圍在130～480 bp。最后，通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，收集數(shù)據(jù)，軟件分析，得出結(jié)論。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失、重復(fù)突變，那么相應(yīng)探針擴(kuò)增峰便會缺失、降低或增加，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異?；螯c(diǎn)突變存在[36，37]。

該法高效、特異，在一個PCR反應(yīng)中可以同時擴(kuò)增數(shù)十個探針的連接產(chǎn)物，可用40～50對特異探針，一次性檢測40～50種突變類型，可以檢測45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，實現(xiàn)了高通量的缺失檢測。同時該技術(shù)所具有的相對定量能力還能對基因的重復(fù)進(jìn)行判斷。但需要毛細(xì)管電泳裝置，試劑盒價格較高，只能檢測已知突變。

3.2.3.5 蛋白截短測試法(protein truncation test, PTT) 本方法是從蛋白質(zhì)水平的變化來檢測基因突變， 它主要檢測導(dǎo)致開放閱讀框架改變的堿基缺失或插入突變等。檢測時須提取細(xì)胞mRNA，將待測靶基因逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所用逆轉(zhuǎn)錄引物含一段T7啟動子和真核細(xì)胞翻譯起始序列，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在無細(xì)胞提取液中翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)。如果基因突變導(dǎo)致了開放閱讀框架的改變，那么合成的蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉--聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離時會出現(xiàn)比正常蛋白質(zhì)或長或短的蛋白產(chǎn)物[38，39]。

本法突變檢出率高，一次可處理大量的樣品，并可檢測4～5 kb片段的突變。但不能檢測不影響開放閱讀框架的突變，且需要抽提組織mRNA。另外，移碼突變?nèi)绻拷虻?′端或3′端，用聚丙烯酰胺凝膠電泳也無法檢測出，由差異剪切所形成的異構(gòu)體也會影響結(jié)果的分析。

3.2.4 基因芯片技術(shù)(DNA chip) 用于檢測已知突變，是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術(shù)。按應(yīng)用的不同，基因芯片可分為基因表達(dá)譜芯片和寡核苷酸芯片；按核酸探針的不同，可分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片；按介質(zhì)的不同，可分為玻璃片、硅片、尼龍膜、陶瓷和微型磁珠等；按用途的不同，可分為表達(dá)譜芯片、診斷芯片、測序芯片、毒理芯片和指紋圖譜芯片等；按點(diǎn)樣方法的不同，可分為光刻基因芯片、機(jī)械微型點(diǎn)樣基因芯片、液體噴射技術(shù)基因芯片等；按制備方法的不同，可分為原位合成和直接點(diǎn)樣[40]?；蛐酒夹g(shù)集合了集成電路計算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)，可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面也有廣闊的前景。DNA芯片技術(shù)將生物技術(shù)和信息技術(shù)有機(jī)結(jié)合，是今后基因診斷的發(fā)展方向和趨勢[40-42]。

該技術(shù)檢測信息高通量，自動化程度高，一次可檢測眾多突變位點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測中發(fā)揮非常重要的作用，可用于疾病臨床早期診斷和批量篩選，確定疾病亞型和選擇最佳治療方案，也可用于耐藥基因的篩選以及新藥的研發(fā)。PCR核酸診斷技術(shù)雖經(jīng)典，但難以滿足現(xiàn)今檢驗、檢疫需求，而“微流控芯片技術(shù)”既含蓋微流體操作系統(tǒng)又滿足實驗結(jié)果的分析功能。由于芯片“實驗室”排污很少，故被稱作是一種“綠色”技術(shù)[41，42]。芯片技術(shù)雖然優(yōu)點(diǎn)眾多，但成本高，技術(shù)含量高，目前普及推廣還有一定難度。

3.2.5 DNA序列分析(DNA sequencing) DNA序列分析是一種非常重要的基因診斷技術(shù)，被稱為是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。近10年來發(fā)展非常迅速，從第一代Sanger法測序開始，經(jīng)歷第二代的高通量測序技術(shù)，至今已發(fā)展到第三代—單細(xì)胞測序技術(shù)。

關(guān)于1～3代測序技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、在基因診斷中的應(yīng)用以及三代測序技術(shù)特點(diǎn)的比較，詳見文獻(xiàn)[43]，本文不再贅述。

4 未來展望

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，憑借人體基因密碼預(yù)測遺傳性骨病的風(fēng)險性和發(fā)展進(jìn)程，做到早檢測、早預(yù)防、早治療，基因診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用將有更加廣闊的前景。展望未來，我們可以預(yù)見：①染色體水平與基因水平的檢測將結(jié)合得更加緊密；②高通量、自動化、低成本獲得更大發(fā)展；③PCR技術(shù)將以優(yōu)化反應(yīng)和拓展應(yīng)用為主，隨著反應(yīng)速度、延伸范圍和檢測成本的不斷優(yōu)化，PCR技術(shù)將繼續(xù)引領(lǐng)現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展；④無創(chuàng)性產(chǎn)檢將相當(dāng)普及，PGD也將進(jìn)入到一個更普及的階段；⑤群體篩查的項目將更多，技術(shù)手段將更高、更快捷、更準(zhǔn)確；⑥隨著儀器成本的降低、小型化，試劑、試劑盒的大量研發(fā)，個體化、自主化檢測程度將更加提高；⑦臨床與基礎(chǔ)研究結(jié)合將更加密切，研究成果將更加及時應(yīng)用于臨床診防治，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)得到充分體現(xiàn)；⑧每個人一生的生老病死有望在胚胎早期就被解讀、破譯，疾病的預(yù)防有望得到更早期、更有效的控制；⑨可以為基因治療尋找更多新的治療靶點(diǎn)，從而促進(jìn)基因治療的迅猛發(fā)展。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.004

R714.55

A

2015-07-21)