丁紅珂 綜述 尹愛華 校審

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

非綜合征性遺傳性耳聾的基因診斷進(jìn)展

丁紅珂 綜述 尹愛華 校審

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

非綜合征性耳聾是感官缺陷中最常見的一類疾病。耳聾基因診斷正在經(jīng)歷從一代測序到各種高通量測序平臺的技術(shù)變革，針對不同人群有相應(yīng)的檢測手段?；蛟\斷對于早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防、耳毒性藥物應(yīng)用及生育風(fēng)險評估有重要指導(dǎo)意義。

非綜合征性耳聾；基因診斷；目標(biāo)基因捕獲；高通量測序

耳聾是全球公共衛(wèi)生非常關(guān)注的一類影響人類健康的疾病。在我國，平均每年每200萬的新生兒中就有30 000個嬰兒罹患先天性耳聾[1，2]，與各國統(tǒng)計(jì)的每1000個新生兒中有1～3個患兒[3]的發(fā)病率相似。據(jù)估算，我國每年增加藥物性耳聾和遲發(fā)性耳聾導(dǎo)致兒童聽力障礙的約30 000余人[4]。耳聾已嚴(yán)重影響了我國人口素質(zhì)，增加了國民醫(yī)療負(fù)擔(dān)。粗略估計(jì)大約有50%的學(xué)語前聽力障礙都是由遺傳性因素引起[5]。由于在兒童早期缺乏適當(dāng)?shù)穆犛X刺激和充分的語言暴露感知，中度及以上的聽力障礙嚴(yán)重阻礙了語言能力的學(xué)習(xí)、認(rèn)知的發(fā)展和心理機(jī)能的發(fā)育等[4]，成為聽障患者人際交流和融入社會的主要障礙[6]。

為有效減少兒童聽力語言障礙的發(fā)生，新生兒聽力篩查的推廣可以實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)和早康復(fù)的目的。但是聽力篩查有諸多局限性，初篩、復(fù)篩到最終確診可因新生兒家長的拖延而延誤，另外對于線粒體基因突變引起的藥物性耳聾也無法實(shí)現(xiàn)很好的預(yù)防目的[4]，因此結(jié)合有效的常見致病基因突變篩查，可以快速了解新生兒耳聾基因攜帶情況，達(dá)到快速診斷的目的，對發(fā)現(xiàn)的患兒進(jìn)行學(xué)語前能力的早期干預(yù)或藥物性耳聾攜帶者的用藥指導(dǎo)意義重大。

近90%～95%的聽力障礙和聽力困難的患兒出生于聽力正常的家庭[7]，因此清楚地了解育齡期婦女的耳聾突變攜帶率及相關(guān)致病基因的突變譜情況，對于攜帶者的檢出、配偶基因檢測及準(zhǔn)確的遺傳咨詢是很重要的[8]。具有耳聾家族史的家庭，需通過詳細(xì)的遺傳咨詢了解先證者的情況，有目的地進(jìn)行基因診斷，給家族中的育齡期夫婦提供準(zhǔn)確的遺傳信息。若夫婦雙方均為同一耳聾基因的突變攜帶者時，要適時地選擇產(chǎn)前診斷來評估胎兒的發(fā)病風(fēng)險。

1 遺傳性耳聾概述

先天性耳聾的致病因素大致可以分為遺傳性因素和非遺傳性因素。遺傳因素造成的耳聾約占60%～70%，其中約30%為綜合征性耳聾(syndromic hearing loss，SHL)，70%為非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing loss，NSHL)[9]。NSHL中75%～80%主要呈常染色體隱性遺傳方式(DFNB)，還有20%為常染色體顯性遺傳(DFNA)、2%～5%為X連鎖遺傳(DFNX)及1%的線粒體突變母系遺傳[10]。通常情況下，常染色體隱性遺傳的NSHL表現(xiàn)為學(xué)語前的、非進(jìn)行性的(穩(wěn)定的)而且是重度到極重度的耳聾[11]；常染色體顯性遺傳的NSHL主要表現(xiàn)為學(xué)語后的進(jìn)行性耳聾[12]。

基因型與表型之間的相關(guān)性一直是醫(yī)學(xué)工作者和科學(xué)家們所感興趣的，來自基因突變對健康影響的豐富信息已經(jīng)顯著擴(kuò)大了對遺傳性疾病的一般理解[13]。然而對于NSHL而言，要充分理解這些相關(guān)性具有很大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)镹SHL的臨床表型差異大而且遺傳異質(zhì)性非常強(qiáng)[13]。同時NSHL的基因診斷工作也存在一定困難，除了遺傳異質(zhì)性，還由于①NSHL突變種類繁多，如單核苷酸變異、插入缺失突變及拷貝數(shù)目變異等；②非再現(xiàn)性突變占有較高比例；③不同種族的人群突變頻率有很大差異[14]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NSHL相關(guān)致病基因有近100個(http://hereditaryhearingloss.org)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，GJB2(MIM 121011)和SLC26A4(MIM 605646)基因是最主要的兩個致聾基因[15-17]；線粒體12SrRNA基因是最常見的藥物性致聾基因，與氨基糖苷類抗生素致聾密切相關(guān)[18]；GJB3基因與高頻聽力損失有關(guān)[19]。以上4個基因在國內(nèi)為耳聾病因檢測的主要目標(biāo)基因。

2 NSHL主要診斷方法

NSHL主要通過分子水平的基因診斷來確診。聚合酶連反應(yīng)(PCR)技術(shù)[20]和Sanger測序法的問世為DNA分子診斷奠定了基礎(chǔ)[21]。

2.1 早期NSHL致病基因研究 早些年NSHL致病基因的研究主要是全基因連鎖分析結(jié)合Sanger測序法。首先通過對一個臨床診斷相對明確的大家系進(jìn)行全基因組連鎖不平衡分析定位致病關(guān)鍵區(qū)域[22]，然后經(jīng)定位克隆的方法確定致病基因。例如，1988年通過連鎖分析將NSHL首次定位到了Xq染色體區(qū)域[23]，后通過7年的時間找到了POU3F4(MIM 300039)基因[24]；1992年首次定位了NSHL的常染色體區(qū)域5q31[25]，并在隨后的5年發(fā)現(xiàn)了DIAPH1(MIM 602121)基因[26]。通過連鎖分析和定位克隆方法找到的基因還有GJB2(MIM *121011)、TECTA(MIM 602574)(呈顯性遺傳)、COL11A2(MIM 120290)(呈顯性遺傳)、KCNQ4(MIM 603537)、OTOF(MIM 603681)、GJB6(MIM 604418)、MYO3A(MIM 606808)等50多個基因；通過定位克隆后篩選耳聾相關(guān)基因而被發(fā)現(xiàn)的有MYO7A(MIM 276903)、SLC26A4(MIM 605646)、TECTA(呈隱性遺傳)、COL11A2(呈隱性遺傳)4個基因；直接通過定位克隆被發(fā)現(xiàn)的基因有GJB3(MIM 603324)[13]。

早期一些大的耳聾家系對于連鎖分析發(fā)現(xiàn)新的基因確實(shí)提供了非常有價值的遺傳信息，但該方法不適合在一些小的耳聾家系或者散發(fā)病例中應(yīng)用，且早期的基因克隆技術(shù)難度大，耗時漫長。在高通量測序技術(shù)出現(xiàn)之前的很長一段時間里，臨床及實(shí)驗(yàn)室工作者都是采用Sanger測序法對已經(jīng)定位的NSHL候選基因進(jìn)行逐一序列分析。Sanger測序法作為分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確地判斷突變位置及種類，它可以有效地運(yùn)用到有明確耳聾家族史的個體或者耳聾患者本身的分子診斷中，對常見致病基因進(jìn)行突變檢測。但對于大規(guī)模的人群篩查和罕見遺傳性耳聾病例診斷來說，該方法效率相對較低不宜采用。

2.2 高通量測序的應(yīng)用 遺傳性耳聾新基因的發(fā)現(xiàn)速度隨著近幾年高通量測序(next-generation sequencing, NGS)的逐步成熟化而加快。NGS的商業(yè)化發(fā)展，大大降低了測序成本并縮短了檢測時間[27-29]。基于NGS的全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)在疑似單基因疾病的鑒別診斷中具有同時性、廣泛性的巨大潛力[30]，但目前仍然沒有必要在一個大的群體中常規(guī)應(yīng)用全基因組掃描來發(fā)現(xiàn)罕見及新突變[31]，因?yàn)閃GS的成本仍然是相對昂貴的，而且臨床應(yīng)用還有非常多的問題需要解決，如大量編碼區(qū)和非編碼區(qū)的數(shù)據(jù)解讀及與疾病相關(guān)性的分析等，只有當(dāng)我們對基因組非編碼區(qū)的功能有足夠的認(rèn)識后，WGS才能更好地發(fā)揮它的潛能[30]。

近年來，NSHL的新致病基因和新突變主要是通過全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)技術(shù)而被發(fā)現(xiàn)的。WES正在成為發(fā)現(xiàn)遺傳性疾病新致病基因和新突變的有效手段，這是因?yàn)榇蟛糠置系聽栠z傳性疾病都是由致病基因的外顯子或者剪切區(qū)域的突變引起，而這部分序列僅僅只占到人基因組的1%[32]。MCM2(MIM 116945)在一個中國家系中被發(fā)現(xiàn)為一個新的NSHL致病基因[33]，該基因突變可以引起DFNA。TBC1D24(MIM 613577)、P2RX2(MIM 600844)[34]、TNC(MIM 187380)[35]、EPS8(MIM 600206)[36]、OSBPL2(MIM 606731)[37]等10多個基因被發(fā)現(xiàn)為NSHL新的相關(guān)致病基因，另有30多個新突變已被WES檢測出來與NSHL相關(guān)[30,38]。

盡管WES在疾病基因檢測這一領(lǐng)域快速地發(fā)展成熟，且對于無法進(jìn)行連鎖分析的NSHL小家系或者罕見散發(fā)病例來說，用常規(guī)手段排除常見致病基因后，WES可以作為有效的檢測方法，但該法仍不適合大規(guī)模的人群篩查。NSHL具有一些常見突變位點(diǎn)，沒有必要對人群進(jìn)行所有基因的外顯子檢測，這樣既浪費(fèi)成本又增加受檢者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且檢測出來的大量遺傳變異的數(shù)據(jù)分析也是一大問題。

2.3 目標(biāo)基因捕獲及芯片技術(shù)的應(yīng)用 對NSHL致病基因的研究目前更傾向于目標(biāo)基因捕獲(targeted gene capture, TGC)技術(shù)的應(yīng)用。NGS處理過程中沒有選擇性區(qū)域富集，任何一個基因組區(qū)域被測序的機(jī)會都是均等的。而TGC是基于分子雜交的捕獲技術(shù)，又分為液相和固相兩種。通常液相雜交使用生物素標(biāo)記的DNA或者RNA探針，又稱液相芯片技術(shù)。這些寡核苷酸的DNA或者RNA探針長度約120 bp與目標(biāo)基因序列完全互補(bǔ)配對，并采用疊瓦式設(shè)計(jì)來提高目標(biāo)區(qū)域的捕獲效率[39]。固相雜交通常是將DNA探針固定到固體支持物上，例如玻璃微陣列芯片[40-42]。可見TGC技術(shù)中目標(biāo)區(qū)域通過與特定的DNA或RNA探針結(jié)合得到富集從而增加了測序深度[39]。與NSHL相關(guān)的致病基因和位點(diǎn)有100個之多，按照30×的測序深度，一個人基因組(大約3.2 Gbp)通過NGS測序獲得的序列大約在100 Gbp，相當(dāng)于將目標(biāo)基因捕獲的測序深度增加了至少1000倍[43-45]。因此相同的測序容量，如果只研究耳聾致病基因，理論上可以完成至少1000個標(biāo)本的序列分析，大大提高了檢測效率，也降低了檢測成本。TGC的優(yōu)勢在于，任何一個感興趣的基因組區(qū)域都可以被設(shè)計(jì)出來而達(dá)到被富集的目的，例如，可以把所有與NSHL相關(guān)的致病基因的所有外顯子設(shè)計(jì)在一個panel中進(jìn)行富集檢測，因此TGC比WES更有針對性，目標(biāo)區(qū)域更明確，適合于遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)的NSHL致病突變研究。然而TGC-panel的一個主要缺陷是隨著致病基因數(shù)的增加需要重新定制[38]，富集了大量致病位點(diǎn)的TGC與WES類似，并不適用于人群篩查。

NSHL的致病基因和突變種類繁多，但在特定人群中存在一些熱點(diǎn)突變，利用這些熱點(diǎn)突變進(jìn)行人群攜帶者的篩查是非常有意義的[46,47]。國內(nèi)北京博奧生物(CapitalBio，Beijing，China)研發(fā)的微陣列芯片檢測平臺，是針對中國人群的9個突變熱點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，來自對28個省和自治區(qū)的大規(guī)模人群流行病學(xué)研究[48-52]分析得到，這9個熱點(diǎn)突變可以解釋>80%的遺傳性耳聾。目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室多數(shù)采用該芯片平臺進(jìn)行普通人群篩查[53,54]，也包括育齡期婦女及新生兒的基因篩查。

3 NSHL基因診斷策略總結(jié)

NSHL基因診斷的方法越來越多，如何在臨床病例中運(yùn)用好這些方法，或者說針對不同的病例如何選擇合適的方法是需要全面考慮的。下面就不同人群簡述一下適合的檢測手段。

3.1 正常人群/育齡期婦女基因篩查 博奧生物研發(fā)的NSHL常見致病位點(diǎn)的微陣列芯片雜交在國內(nèi)已經(jīng)廣泛用于普通人群的篩查，目前該款基因芯片包含有9個NSHL常見位點(diǎn)：GJB2基因c.35 del G、c.235 del C、c.299 del AT和176 del 16bp，SLC26A4基因IVS7-2 A>G和c.2168 A>G，GJB3基因c.538C>T，線粒體12SrRNA基因c.1555A>G和c.1494C>T。對于篩查出突變的攜帶者，建議其配偶進(jìn)行相應(yīng)基因的全部外顯子Sanger測序法，如果同時檢測到為基因突變攜帶者，則需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷來確定胎兒攜帶耳聾致病基因的情況。

3.2 新生兒基因篩查 9個常見位點(diǎn)的芯片平臺也適用于新生兒基因篩查。一方面，被診斷為攜帶線粒體基因突變的新生兒，通過用藥指南提示臨床醫(yī)生終身嚴(yán)禁使用氨基糖苷類藥物，避免藥物性聾的發(fā)生；另一方面，篩查為其他耳聾突變的個體，結(jié)合新生兒聽力篩查判斷是確定攜帶者，還是隱性患者。如果聽力篩查存在異常，則可以有針對性的進(jìn)行相應(yīng)基因的Sanger測序分析，尋找另一個突變位點(diǎn)進(jìn)行確診，實(shí)現(xiàn)早期診斷。

3.3 有耳聾家族史的個體基因診斷 生育過耳聾患兒的夫婦雙方就診時，建議先確定患兒的致病基因型，可首先采用Sanger測序法針對耳聾常見幾個致病基因進(jìn)行序列分析，未發(fā)現(xiàn)突變的情況下，可以行TGC或者WES的策略進(jìn)行分析；高通量測序找到致病突變后，要使用Sanger測序法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，確認(rèn)無誤后，應(yīng)分別檢測突變的父母方來源，最終有目的地進(jìn)行產(chǎn)前診斷評估再生育風(fēng)險。

對于有家族史的個體來說，與上述診斷方法相同，都是首先確定家族先證者的致病基因型，再對其他親屬進(jìn)行有針對性的基因分析。分析策略需從常見致病基因入手，常見位點(diǎn)的芯片檢測加上Sanger測序法，排除常見位點(diǎn)后，可以考慮采用TGC的方法，如果TGC仍然不能發(fā)現(xiàn)致病突變，或者患者臨床表型確系非常罕見的情況下，WES則可以作為下一步需要考慮的策略。

總之，需要結(jié)合就診者自身的患病情況和經(jīng)濟(jì)狀況來選擇適宜的檢測手段。

4 展 望

遺傳性耳聾的基因診斷對耳聾的預(yù)測、預(yù)防和早期人工耳蝸的植入有重要的指導(dǎo)意義，對均為耳聾突變攜帶者的夫婦雙方提供再生育風(fēng)險的評估也有重要價值，因此，耳聾基因診斷的有效性直接關(guān)系到每個患者的個人利益。然而耳聾這一表型又具有非常復(fù)雜的臨床差異，從非綜合征到各種綜合征，耳聾的發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度以及進(jìn)展程度都各不相同，對應(yīng)的致病基因更是不勝枚舉。

針對大規(guī)模的正常人群需要建立有效快速的耳聾基因篩查手段，根據(jù)國內(nèi)突變分布情況選擇最常見的突變類型進(jìn)行普查，微陣列芯片技術(shù)非常適于該類檢測，通量相對較高，檢測周期短，成本相比高通量測序具有很大優(yōu)勢。對于臨床表型非常罕見的耳聾患者，首先采用Sanger測序分析排除最常見的致病基因后，可以考慮TGC的方法，目前國內(nèi)的很多機(jī)構(gòu)都在研發(fā)NSHL的TGC平臺，有望很快投入商業(yè)化應(yīng)用。WES可作為補(bǔ)充方法，有利于發(fā)現(xiàn)新基因和新突變。在未來很長一段時間內(nèi)TGC和WES都可能會成為NSHL基因研究的主要手段。根據(jù)不同病人的不同情況，結(jié)合以上各項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢盡可能地解決臨床面臨的問題。

NGS技術(shù)剛剛起步，現(xiàn)階段是發(fā)現(xiàn)新基因和新突變的爆發(fā)期，但隨之而來的應(yīng)該是與之相匹配的生物信息學(xué)的發(fā)展時代，海量的數(shù)據(jù)需要一套行之有效的生物信息學(xué)工具來進(jìn)行分析、臨床信息的提取、與疾病之間關(guān)系的預(yù)測等。突變位點(diǎn)的功能學(xué)研究也是未來的一個重點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)突變很容易實(shí)現(xiàn)，但解釋所發(fā)現(xiàn)的突變與疾病之間是否存在因果關(guān)系，需要從不同層面去驗(yàn)證。功能學(xué)研究還可能為遺傳性耳聾的基因治療提供有意義的分子靶向目標(biāo)。只有明確了遺傳變異與疾病的真正關(guān)系之后，我們才能從分子水平更好地解釋臨床病患的原因，更準(zhǔn)確地指導(dǎo)、服務(wù)于病人，實(shí)現(xiàn)真正意義上的早診斷和早預(yù)防。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2015.04.012

R714.55

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2015-09-14)