李婥 楊春艷尚江華 鄭海英 黃芬香

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

我國(guó)水牛繁殖生物技術(shù)研究進(jìn)展

李婥 楊春艷*尚江華 鄭海英 黃芬香

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

水牛適應(yīng)和抗病力性強(qiáng)、耐高溫高濕、耐粗飼、易飼養(yǎng)、使用年限長(zhǎng)，非常適合我國(guó)南方的飼料資源和氣候條件，而且水牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，現(xiàn)今我國(guó)正致力于發(fā)展水牛奶業(yè)。引入的河流型水牛，體格大，生長(zhǎng)快速，產(chǎn)奶量高，與本地水牛雜交后代的奶水牛產(chǎn)奶量達(dá)到1200～2000kg，可顯著提高本地水牛的產(chǎn)奶性能。但由于水牛的繁殖性能低下，我國(guó)水牛雜交改良面臨著良種種源匱乏的問(wèn)題，要突破這個(gè)瓶頸，必須集成現(xiàn)代動(dòng)物繁殖技術(shù)（如人工授精、超數(shù)排卵、體外胚胎生產(chǎn)、核移植、轉(zhuǎn)基因和胚胎移植等技術(shù)），以提高水牛的繁殖效率和種源供應(yīng)能力，從而促進(jìn)我國(guó)水牛品種改良和水牛奶業(yè)開(kāi)發(fā)。近年來(lái)，圍繞水牛繁殖生物技術(shù)已開(kāi)展了大量的研究，下面就此作一綜述。

1 超數(shù)排卵和同期發(fā)情

一般母牛每次發(fā)情只排一個(gè)卵。人們通過(guò)使用外源激素，能使母牛一次排多個(gè)卵以生產(chǎn)多個(gè)胚胎，并通過(guò)胚胎移植加快優(yōu)良母畜基因型的擴(kuò)散。水牛卵巢上原始卵泡數(shù)分別比奶牛低30%，卵泡閉鎖率較奶牛高，且水牛對(duì)超排藥物的反應(yīng)力低，個(gè)體反應(yīng)差異大，因此胚胎回收率遠(yuǎn)低于奶牛。近年來(lái)，水牛的胚胎回收率雖已有很大提高，可用胚胎可高達(dá)2.5～3.0枚，但大多數(shù)仍在1.0～2.0枚范圍內(nèi)。

常用于水牛超排的促性腺激素有PMSG（孕馬血清促性腺激素）和FSH（促卵胞素）。PMSG和FSH用于水牛超排處理的反應(yīng)已有很多試驗(yàn)研究，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明FSH（總劑量為30～50mg）的超排效果優(yōu)于PMSG（總劑量為2000～3000國(guó)際單位），每次超排獲得有效胚胎的數(shù)量是2.09比0.56[1-2]。

同期發(fā)情技術(shù)可便于掌握適時(shí)輸精，縮短發(fā)情配種時(shí)間，有利于提高人工授精配種受胎率和胚胎移植受胎率。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)水牛同期發(fā)情技術(shù)的應(yīng)用做了一些研究，已發(fā)展了多種同期發(fā)情方法用于誘導(dǎo)水牛的發(fā)情和排卵，如孕酮法、兩次PGF2α法等。研究表明通常有優(yōu)勢(shì)卵泡和黃體存在時(shí)處理成功率較高；在繁殖季節(jié)同期發(fā)情的效果較好；在乏情季節(jié)，結(jié)合使用孕酮可提高受胎率。

蔣如明等（2003）應(yīng)用孕酮陰道栓結(jié)合氯前列烯醇（CIDR+PGc）誘導(dǎo)本地母水牛同期發(fā)情，同期發(fā)情率高達(dá)85.13%，單獨(dú)應(yīng)用氯前列烯醇（PGc）或孕酮陰道栓（CIDR），同期發(fā)情率也分別達(dá)到64.18%、73.01%。而和占星等（2005）運(yùn)用國(guó)產(chǎn)氯前列烯醇處理云南水牛的胚胎移植試驗(yàn)時(shí)，供、受體的同期發(fā)情率均較低，只有43.33%。

2 水牛胚胎體外生產(chǎn)

胚胎體外生產(chǎn)（Invitroproduction，IVP）包括卵母細(xì)胞體外成熟（Invitromaturation，IVM）、 體外受精（Invitrofertilization，IVF） 和體外胚胎培養(yǎng)（Invitroculture，IVC)。通過(guò)IVP可大量生產(chǎn)良種胚胎，是解決水牛品種改良過(guò)程中胚胎來(lái)源困難的一條有效途徑。Madan等1991年獲得世界上第一頭體外受精水牛犢，我國(guó)于1993年獲得第一頭體外受精水牛犢。

胚胎體外生產(chǎn)的卵母細(xì)胞來(lái)源主要分為屠宰場(chǎng)卵巢和活體采卵（Ovumpick-up，OPU）。屠宰場(chǎng)卵巢容易獲得，但由于系譜不明確，且絕大部分為沼澤型水牛卵巢，因此對(duì)水牛品種改良的意義不大。OPU通過(guò)B型超聲波引導(dǎo)，經(jīng)子宮壁采集卵母細(xì)胞，可重復(fù)從遺傳價(jià)值高的水牛采集卵母細(xì)胞，其與體外受精技術(shù)相結(jié)合可生產(chǎn)大量系譜明確的胚胎，從而充分利用優(yōu)良母畜的遺傳潛力。OPU與體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)的可移植胚胎為超數(shù)排卵的2～3倍，每頭供體每月可生產(chǎn)更多的可移植胚胎（2.0±0.6枚），并可克服母畜生殖道疾病對(duì)胚胎質(zhì)量的影響[3-6]。

近二十年來(lái)，水牛體外胚胎生產(chǎn)取得了較大的進(jìn)步，但生產(chǎn)效率仍然較低。國(guó)內(nèi)所報(bào)道的水牛卵母細(xì)胞的成熟率、卵裂率和囊胚率分別為51.7～80%、52.7～60%和18.5～28.8%。關(guān)于水?；铙w采卵-胚胎體外生產(chǎn)目前主要在廣西水牛研究所開(kāi)展，黃右軍等（2004）經(jīng)活體采卵平均每頭次獲可用卵母細(xì)胞3.18±2.89枚，采集的可用卵母細(xì)胞以MC和SOF兩種系統(tǒng)培養(yǎng)，受精分裂率和囊胚率分別為45.2%、30.6%和70.8%、18.8%[6]。黃芬香等（2009）比較了不同季節(jié)的活采效果，發(fā)現(xiàn)季節(jié)之間卵母細(xì)胞可用率和受精卵分裂率沒(méi)有差異，但秋冬季的囊胚率（27.09%）則明顯高于春季的20.95%和夏季的20.45%[5]。

水牛的成熟培養(yǎng)系統(tǒng)一般為含10%FBS的TCM199液中添加促性腺激素FSH、LH、類(lèi)固醇激素E2、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和硫醇類(lèi)化合物β-巰基乙醇。水牛體外受精液中多添加肝素和咖啡因，而王啟勝等（2001）在受精液和早期胚胎培養(yǎng)液中添加輸卵管上皮細(xì)胞+顆粒細(xì)胞或牛磺酸，囊胚率分別為28.1%和20%，均極顯著高于對(duì)照組。水牛受精卵的體外囊胚發(fā)育率在多數(shù)實(shí)驗(yàn)中都只達(dá)15～30%，在培養(yǎng)水牛胚胎時(shí)除了少數(shù)研究使用化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基外，大多數(shù)仍采用含有血清和體細(xì)胞的復(fù)雜培養(yǎng)液，并發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)層細(xì)胞有助于促進(jìn)胚胎越過(guò)8～l6細(xì)胞期阻滯。在胚胎培養(yǎng)液中加入IGF-l、胰島素、重組BSA、EGF和ITS可提高囊胚發(fā)育率 [7]。

3 水牛胚胎移植

胚胎移植是水牛超數(shù)排卵、體外受精、體細(xì)胞核移植的最終環(huán)節(jié)，對(duì)良種水牛的擴(kuò)繁具有重要意義。胚胎移植首先要解決供體母牛與受體母牛發(fā)情同期化問(wèn)題，常用的方法與供體母牛情期同期化處理基本一樣，受體母牛注射兩次PG或其衍生物，使注射間隔時(shí)間l1d。由于水牛黃體突出表面不明顯，難以觸診，給胚胎移植準(zhǔn)確到位造成一定困難。母水牛子宮頸在發(fā)情后不久就處于基本閉鎖狀態(tài)，使輸胚管插入困難并容易造成子宮損傷，影響胚移受胎率。為了提高受胎率，選用已產(chǎn)2胎以上的母牛作為受體母牛較好[8]。

目前水牛鮮胚移植受胎率一般只有6～l3%，個(gè)別試驗(yàn)受胎率達(dá)到33.7～66.7%，胚移受孕水牛3個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)比較嚴(yán)重，流產(chǎn)率有時(shí)達(dá)到40～50%。黃右軍等（2002）由2頭經(jīng)超數(shù)排卵處理的母水牛，授精后第5d非手術(shù)回收3枚囊胚，說(shuō)明受精卵在體外發(fā)育速度比在體內(nèi)發(fā)育慢，推測(cè)試管水牛胚胎移植的適宜時(shí)間，應(yīng)是受體母牛站立發(fā)情后第4～6d。黃右軍等（2004）在受體母牛發(fā)情后第4～6d進(jìn)行胚胎移植，結(jié)果鮮胚受胎率：第4d為48.1%，第5d為28.0%，第6d為31.3%，平均為36.2%，說(shuō)明在此段時(shí)間移植6～8d的體外胚胎（囊胚）是適宜的。以每頭次2枚體外胚胎（鮮胚或凍胚）移植受體母牛，鮮胚移植受胎率為36.2%，產(chǎn)下21頭試管水牛；凍胚移植受胎率為20.0%，產(chǎn)下3頭凍胚試管水牛[8]。

4 水牛胚胎冷凍

胚胎冷凍技術(shù)可突破時(shí)間和空間的限制，解決胚胎生產(chǎn)與移植在時(shí)間和地域方面的矛盾，實(shí)現(xiàn)水牛胚胎本地生產(chǎn)異地移植，還可長(zhǎng)時(shí)間保存優(yōu)良種水牛的遺傳資源，便于胚胎運(yùn)輸，促進(jìn)水牛繁殖生物技術(shù)的推廣應(yīng)用。1990年，Misra首次采用程序化冷凍獲得了水牛凍胚移植成功。在我國(guó)，石德順等于1999年成功獲得首例受精卵冷凍保存的試管牛。張秀芳等（2007）采用甘油對(duì)體外受精胚胎進(jìn)行程序化冷凍，解凍后凍胚成活率達(dá)到了73.4～75.0%[6]。

盡管以上研究已驗(yàn)證了水牛胚胎冷凍的可行性，但水牛胚胎的冷凍還沒(méi)得到廣泛的應(yīng)用。

5 水牛性別控制

使用性別控制技術(shù)進(jìn)行繁育奶水牛的效率將比無(wú)性別控制的提高近一倍，對(duì)加速繁殖良種水牛，解決制約我國(guó)水牛奶業(yè)的發(fā)展瓶頸——良種水牛缺乏，推動(dòng)中國(guó)水牛奶業(yè)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前，實(shí)現(xiàn)家畜性別的人為控制主要有兩個(gè)途徑：一是X精子和Y精子的分離；二是早期胚胎的性別鑒定。

自2004年開(kāi)始，廣西大學(xué)專(zhuān)家將牛的精子分離后進(jìn)行人工授精，產(chǎn)下母水牛的成功率94%，公水牛的成功率是91%。盧克煥等（2006）使用流式細(xì)胞分類(lèi)儀分離X、Y精子，準(zhǔn)確率達(dá)到90%以上，分離的精子用于體外受精，生產(chǎn)的胚胎移植后產(chǎn)下經(jīng)XY精子性別控制的雌雄水牛雙犢[9]。

關(guān)于胚胎的早期性別鑒定，武建中等（2006）報(bào)道通過(guò)連續(xù)多重PCR方法擴(kuò)增公牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1.715衛(wèi)星DNA序列，能夠有效的對(duì)水牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定[10]。

6 水牛體細(xì)胞核移植及轉(zhuǎn)基因研究

體細(xì)胞核移植在短期內(nèi)可大量復(fù)制具優(yōu)良基因的動(dòng)物個(gè)體，并為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。水牛的體細(xì)胞核移植研究開(kāi)始較晚，石德順等人于2005年報(bào)道了首例水牛體細(xì)胞克隆牛犢的誕生[16]。核移植操作復(fù)雜，影響因素多，針對(duì)水牛體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞類(lèi)型、供體細(xì)胞處理方法開(kāi)展了大量的研究，這些研究都表明采用顆粒細(xì)胞（囊胚率為9.8～22.5%）和胎兒成纖維細(xì)胞（囊胚率為8.7～31.45%）的核移植效率好于耳成纖維細(xì)胞（囊胚率為7.0～10.9%）；采用細(xì)胞處理可提高核移植效率，最佳處理方法為阿菲迪霉素和血清饑餓聯(lián)合處理（囊胚率為21.3～31.45%），其效果要好于單獨(dú)的血清饑餓法（囊胚率為7.6～10.6%）和接觸抑制法（囊胚率為 8.7～9.5%）[12-13]。

陸鳳花（2005）探討了電融合參數(shù)對(duì)水牛體細(xì)胞核移植效果的影響，最適宜的電融合參數(shù)為100V/mm，15μs，3次電脈沖；將來(lái)自一頭22歲摩拉公牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的胚胎移植后，妊娠到第215d[14]。石德順等（2007）采用阿菲迪霉素和血清饑餓聯(lián)合處理可有效將體細(xì)胞同步于G0/G1期，核移植重構(gòu)胚的囊胚率為21.3～22.2%；將42枚胚胎移植入21頭受體，4頭妊娠，產(chǎn)出并存活世界第一頭克隆水牛犢 [11]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因工程和胚胎工程結(jié)合的一門(mén)生物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)是使用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將選定的目的基因?qū)雱?dòng)物染色體組，并整合表達(dá)和遺傳的過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆的方法對(duì)水牛進(jìn)行定向遺傳改良和研發(fā)高效乳腺生物反應(yīng)器，可解決我國(guó)水牛奶業(yè)開(kāi)發(fā)面臨的水牛繁殖率低和產(chǎn)奶量低等問(wèn)題，提高水牛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

董克家等（2003）構(gòu)建人FSHβ乳腺定位表達(dá)載體Plxin-hFSHβ，通過(guò)精子載體法，獲得一頭轉(zhuǎn)基因水牛犢，并通過(guò)T-A克隆和測(cè)序分析檢測(cè)了人FSHβcDNA整合情況。韋精衛(wèi)等（2008）以含neo和GFP基因雙標(biāo)記的水牛、黃牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行牛轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植，所構(gòu)建的重組胚，2-細(xì)胞階段觀察不到GFP的表達(dá)，4-細(xì)胞以后GFP的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞均可檢測(cè)到GFP的表達(dá)，將黃牛同種轉(zhuǎn)基因克隆囊胚進(jìn)行移植，獲得1例妊娠；并且異種核移植重組胚中可檢測(cè)到GFP表達(dá)，GFP可作為異種核移植胚胎來(lái)源的一種新標(biāo)記，為下一步的轉(zhuǎn)基因克隆水牛生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[15]。

7 存在問(wèn)題

（1）超數(shù)排卵和同期發(fā)情的效率仍然較低，需要制訂中長(zhǎng)期的研究計(jì)劃，探討水牛卵泡發(fā)生和繁殖內(nèi)分泌規(guī)律，找出有效的發(fā)情鑒定方法。體外胚胎生產(chǎn)雖然也取得一些成績(jī)，但實(shí)質(zhì)上仍處于研究階段，還未能真正應(yīng)用于生產(chǎn)。今后應(yīng)降低胚胎體外生產(chǎn)的成本，提高體外成產(chǎn)效率。

（2）水牛胚胎冷凍缺乏系統(tǒng)研究，還未能建立一套適合于水牛的胚胎冷凍程序。

（3）體細(xì)胞核移植操作條件要求高，且需要高昂的儀器設(shè)備，不能在基層應(yīng)用，急需建立簡(jiǎn)單高效的徒手克隆技術(shù)體系。

（4）水牛轉(zhuǎn)基因的研究開(kāi)展較晚，目前研究成果還缺乏。

8 結(jié)語(yǔ)

水牛的繁殖受氣候和季節(jié)的影響大，發(fā)情征兆不明顯給發(fā)情鑒定帶來(lái)一定困難、發(fā)情間隔時(shí)間長(zhǎng)、受胎率低，這些因素制約著水牛的繁殖力。盡管如此，通過(guò)科研人員對(duì)水牛繁殖內(nèi)分泌學(xué)的研究，以及對(duì)水牛人工授精、胚胎移植、體外受精、胚胎冷凍等生物技術(shù)的研究，使水牛繁殖性能的提高呈現(xiàn)了希望。隨著幼畜超數(shù)排卵技術(shù)（Juvenile In Vitro Embryo Transfe，JIVET）、核移植、轉(zhuǎn)基因等新興生物技術(shù)在水牛上的研究，相信將來(lái)水牛的遺傳潛力會(huì)得到更好的發(fā)掘，水牛奶業(yè)也將得到快速發(fā)展。

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廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFBO018045）。

李婥（1979-），女，廣西人，學(xué)士，實(shí)習(xí)研究員。

*通訊作者：楊春艷（1972-），女，副研究員，研究方向：主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。