孫艷（湖北省潛江市動物疫病預防控制中心 433199）

加強獸醫(yī)實驗室建設 提高服務水平

孫艷（湖北省潛江市動物疫病預防控制中心 433199）

獸醫(yī)實驗室不僅要利用血清學、流行病學等技術(shù)手段對動物疫病進行檢測和分析，還必須通過細菌的分離和培養(yǎng)、藥敏試驗以及病原學檢測技術(shù)對動物疫病進行確診，只有防治結(jié)合，才能更好的為畜牧業(yè)服務。

獸醫(yī)實驗室；檢測分析；病原學檢測；服務

近年來，隨著國家動物疫病檢測計劃的實施，獸醫(yī)實驗室發(fā)揮著越來越重要的作用。實驗室能利用血清學、流行病學等技術(shù)手段對動物疫病進行檢測和診斷，為政府部門和養(yǎng)殖企業(yè)提供準確、快速的疫病檢測數(shù)據(jù)和分析報告，協(xié)助制訂科學的防治政策和建立有效的疫病控制計劃與凈化措施，為動物疫病控制和疫情處理的決策提供科學、準確的實驗室技術(shù)依據(jù)，為動物疫病的疫情預報預警、風險評估和免疫效果評價提供科學數(shù)據(jù)，提高潛江市對重大動物疫病早期預警預報能力，動物疫病與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的追蹤溯源能力，處理緊急重大動物疫情和突發(fā)動物公共衛(wèi)生事件的應急反應能力，保障潛江市畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，保護人民身體健康。

1 獸醫(yī)實驗室的現(xiàn)狀

1.1 實驗室基本情況

本中心實驗室建筑面積320m2，屬于生物安全一級實驗室。中心實驗室設有解剖室、檔案室和樣品保存室、儀器室、洗滌消毒室、血清學檢測室，主要負責實驗室檢測業(yè)務的受理、樣品處理和保存、流行病學調(diào)查和分析及日常管理工作。

1.2 實驗室工作人員情況

中心實驗室共有專業(yè)技術(shù)人員3名，其中高級獸醫(yī)師2名，中級獸醫(yī)師1名。

1.3 實驗室開展檢測項目

目前實驗室以抗體檢測為主，開展了豬瘟ELISA試驗、豬（牛）口蹄疫間接血凝試驗、雞新城疫和禽流感血凝與血凝抑制試驗、布氏桿菌玻板凝集試驗和血吸蟲金標免疫試驗。2014年本中心監(jiān)測計劃：豬瘟檢測1320份、口蹄疫檢測1760份、禽流感檢測4360份、新城疫檢測440份、血吸蟲病檢測6740份以及布氏桿菌病1000份。

2 提高縣級獸醫(yī)實驗室診斷能力

正確合理的運用抗體檢測技術(shù)，能指導我們正確地及時地進行防疫工作，可為某些疫病的診斷提供必要的依據(jù)，但是存在一定的局限性。隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽集約化飼養(yǎng)程度不斷提高，飼養(yǎng)規(guī)模不斷擴大，飼養(yǎng)密度不斷增加，產(chǎn)品交流更加頻繁，動物疫病已成為制約畜牧業(yè)經(jīng)濟效益的主要因素之一。如果發(fā)生了疫病，我們就必須進行準確的診斷和治療，只有防治結(jié)合，才能更好的為潛江市畜牧業(yè)服務。

2.1 細菌的分離、培養(yǎng)及藥敏試驗

2.1.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是指在人工培養(yǎng)細菌時，提供給細菌生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)的制品?；A培養(yǎng)基中所含的營養(yǎng)物質(zhì)能滿足一般病原菌生長繁殖所需的氮源、碳源和無機鹽等。在基礎培養(yǎng)基的基礎上添加一些特殊成分（如糖類、血液、抑制劑等）則可制成營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。下面僅介紹普通瓊脂培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基的制備。

2.1.1.1 普通瓊脂培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基是常用的固體培養(yǎng)基，包括普通瓊脂平板和普通瓊脂斜面兩種，前者用于分離純種細菌，后者用于增殖純種細菌或保存菌種。材料：①肉水：200ml；②蛋白胨：2g；③氯化鈉：1g；④瓊脂：5g；⑤無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。方法：①按上述數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。②趁熱用pH試紙測酸堿度，用10%碳酸氫鈉校正pH為7.2左右。③15磅高壓蒸汽滅菌20～30min。④趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗臺上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。

2.1.1.2 血液瓊脂培養(yǎng)基

有些細菌其營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷至50℃左右，加入無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%（即每100ml普瓊加入鮮血5ml），在50～60℃的水中水浴混合后，倒入滅菌平皿，保存于4℃冰箱備用。

2.1.2 需氧性細菌分離培養(yǎng)和移植

2.1.2.1 劃線分離培養(yǎng)法

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開呈20度左右的角度；

（2）右手持接種環(huán)，從病料中取少量材料涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰上燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與所涂材料的地方輕輕接觸，開始劃線；

（3）劃線中不宜過多地重復舊線，以免形成菌苔；

（4）接種完畢，在皿底上作好日期和接種者標記，平皿倒扣，置37℃培養(yǎng)24h。

2.1.2.2 純培養(yǎng)的獲得與移植

將劃線分離培養(yǎng)24h的平皿從溫箱取出，挑取單個菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，證明不含雜菌，此時用接種環(huán)挑取單個菌落，移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，所得到的培養(yǎng)物，即為純培養(yǎng)物。

2.1.3 藥敏試驗

（1）于純培養(yǎng)斜面上，挑取相同的菌落4～5個；

（2）接種于肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)6～8h；

（3）校正菌液濁度，使其與標準比濁管（0.5麥氏比濁管）的濃度相同；

（4）用無菌棉拭子取校正過的菌液，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，涂布整個平板表面，多次旋轉(zhuǎn)平板60度，涂布均勻；

（5）在室溫中干燥3～5min后，用無菌鑷子取藥敏紙片，間距不小于24mm，紙片的中心距平板邊緣不小于15mm；

（6）置35℃孵育18～24h后，用標尺量取抑菌圈直徑，直徑越大，對此藥物越敏感。

2.2 病原學檢測技術(shù)

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：

（1）變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈；

（2）退火：（復性）：溫度降到55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

（3）延伸：模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈；

（4）重復循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，每完成一個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍；

（5）將擴增產(chǎn)物進行電泳，紫外凝膠成像儀成像觀察結(jié)果。陽性對照出現(xiàn)清晰目的條帶，陰性對照無帶出現(xiàn)，實驗結(jié)果成立。若被檢樣品出現(xiàn)與陽性對照一樣清晰的條帶，判為陽性，否則為陰性。

3 結(jié)論

科學監(jiān)測和病原檢測、準確分析是保證畜牧業(yè)突破性發(fā)展的基礎，是提前發(fā)現(xiàn)疫情，快速反應，減少損失的有效方法。我們要充分發(fā)揮實驗室資源優(yōu)勢，提高服務技能，逐步擴大服務覆蓋面。