常培葉　趙　平(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古　呼和浩特　00050)

單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法研究進(jìn)展

常培葉趙平1
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050)

〔關(guān)鍵詞〕單核苷酸多態(tài)性;基因

1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者:常培葉(1975-)，女，博士，副教授，主要從事內(nèi)蒙古地區(qū)少數(shù)民族生活習(xí)慣和易感基因的研究。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500～1 000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。SNP分析技術(shù)按其研究對(duì)象主要分為兩大類(lèi)，①對(duì)未知SNP進(jìn)行分析，即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳病的關(guān)系。檢測(cè)未知SNP有許多種方法可以使用，如溫度梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性的高效液相色譜檢測(cè)等，但這些方法只能發(fā)現(xiàn)含有SNP的DNA鏈，不能確知突變的位置和堿基類(lèi)別，要想做到這一點(diǎn)，必須對(duì)那些含有SNP的DNA鏈進(jìn)行測(cè)序。②對(duì)已知SNP進(jìn)行分析，即對(duì)不同群體SNP遺傳多樣性檢測(cè)或在臨床上對(duì)已知致病基因的遺傳病進(jìn)行基因診斷。篩查已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析、突變錯(cuò)配擴(kuò)增檢驗(yàn)、基因芯片技術(shù)等。本文對(duì)SNP檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀予以綜述。

1　基因芯片法

基因芯片是在固相支持介質(zhì)上進(jìn)行分子雜交并原位熒光檢測(cè)的一種高通量SNP分析方法。根據(jù)核苷酸的堿基配對(duì)原理，設(shè)計(jì)兩種或多種探針，在優(yōu)化操作后，探針只與其完全互補(bǔ)的序列雜交，不與含有單個(gè)錯(cuò)配堿基的序列雜交。待測(cè)基因經(jīng)提取擴(kuò)增、熒光化學(xué)標(biāo)記后，與固定的探針進(jìn)行雜交。然后洗去沒(méi)有發(fā)生雜交的樣品，即可檢測(cè)雜交樣品。由于目標(biāo)基因和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度及種類(lèi)相關(guān)，因此通過(guò)激光掃描，可根據(jù)熒光強(qiáng)弱或熒光的種類(lèi)檢測(cè)出被檢序列的堿基類(lèi)別。其優(yōu)點(diǎn)是高通量，一次實(shí)驗(yàn)可對(duì)多個(gè)進(jìn)行大規(guī)模篩選，需要少量的被檢起始材料，操作步驟簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)是芯片設(shè)計(jì)制造昂貴，約有20％的不能證實(shí)。

2　分子內(nèi)標(biāo)法

分子內(nèi)標(biāo)探針能準(zhǔn)確可靠地探測(cè)特異等位基因序列，可用于已知SNP的檢測(cè)和新SNP的發(fā)現(xiàn)。它用熒光染料內(nèi)標(biāo)寡核苷酸制成探針，探針與互補(bǔ)的DNA序列雜交時(shí)，發(fā)出的熒光強(qiáng)度比未雜交的單鏈高許多。作為雜交結(jié)果，熒光強(qiáng)度的變化可以用來(lái)監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)進(jìn)程和鏈熔解曲線，從而識(shí)別SNP的變化。由于探針在反應(yīng)中不依賴(lài)于其二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，對(duì)探針的限制條件較少，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，合成費(fèi)用低，并且有強(qiáng)大可靠的多通路探測(cè)能力。分子內(nèi)標(biāo)法已開(kāi)發(fā)形成Hy-Beacon探針〔1〕，對(duì)NAT2和細(xì)胞色素2D6酶(CYP2D6)的9個(gè)SNP檢測(cè)初步表明，準(zhǔn)確度可達(dá)100％，但該方法的特異性、敏感性仍然在評(píng)價(jià)之中〔2〕

3　雙向等位特異法(Bi-PASA)

Bi-PASA〔3〕是在等位特異PCR法〔4〕的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。PASA其原理是在PCR反應(yīng)體系中，所設(shè)計(jì)的引物3'端與一條待測(cè)等位基因的序列互補(bǔ)，而與另一條等位基因的序列不互補(bǔ)。該方法雖然可檢測(cè)出SNP，但實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)，缺點(diǎn)是該方法在液相中進(jìn)行，因此多重平行反應(yīng)數(shù)量有限，難以實(shí)現(xiàn)SNP的高通量檢測(cè)。

4　以熒光共振能量傳遞(FRET)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

4.1熒光定量PCR技術(shù)(TaqMan技術(shù)) TaqMan探針基于雜交原理，是按常規(guī)方式進(jìn)行體外基因擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中加入針對(duì)位點(diǎn)及側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的探針，該探針只有一個(gè)堿基的差異，分別對(duì)應(yīng)于不同的等位基因，并用熒光標(biāo)記探針。該方法優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)在過(guò)程中進(jìn)行，無(wú)需分離或洗脫過(guò)程，從而減少了污染的可能性;擴(kuò)增產(chǎn)物分析簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、無(wú)需電泳，提高了實(shí)驗(yàn)速度〔5〕，缺點(diǎn)是所設(shè)計(jì)的探針僅有一個(gè)堿基的差異，檢測(cè)結(jié)果存在假陽(yáng)性。

4.2能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的等位特異PCR據(jù)報(bào)道可以將能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記引物法與等位特異PCR法相結(jié)合，應(yīng)用于SNP的檢測(cè)〔6，7〕。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)。

5　變性高效液相色譜(DHPLC)

DHPLC分離DNA分子的原理:純合雙鏈DNA分子的分離類(lèi)似于陰離子交換層析，離子對(duì)反相高效液相色譜法借助吸附在固定相表面的三乙氨基乙酸離子的正電荷與DNA分子的磷酸二酯基團(tuán)的負(fù)電荷間的相互作用，對(duì)雙鏈DNA分子按長(zhǎng)度進(jìn)行分離。DHPLC檢測(cè)〔8〕一個(gè)樣品僅需幾分鐘，為全自動(dòng)化操作，篩檢SNP的效率優(yōu)于各種電泳法，因此可以先通過(guò)DHPLC對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行粗篩，再對(duì)其中峰型特異者測(cè)序確認(rèn)，這樣可以降低成本，提高檢測(cè)SNP的效率。

6　基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

其原理是將變性的單鏈產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后，在硅芯片上進(jìn)行引物的退火、延伸反應(yīng)、突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰。將堿基進(jìn)行一定的修飾，可進(jìn)一步提高敏感性〔9～11〕。該方法優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需對(duì)靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)合了侵染檢測(cè)高效，單堿基擴(kuò)增和基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)快速，準(zhǔn)確及等溫和固相樣本準(zhǔn)備，從而使得該方法適用于高通量SNP的檢測(cè)。

7　多元焦磷酸測(cè)序

在焦磷酸測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)SNP的方法。焦磷酸測(cè)序的原理: PCR擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物變性成單鏈后與一小段測(cè)序引物結(jié)合;測(cè)序時(shí)順序加入脫氧核糖核苷三磷(dNTP)，DNA鏈合成過(guò)程中，如果三磷酸脫氧核苷酸結(jié)合到DNA鏈上，則釋放焦磷酸，反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)的硫酸化酶將焦磷酸轉(zhuǎn)化成三磷酸腺苷(ATP)，熒光素酶利用ATP產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光。如dNTP未能結(jié)合在DNA鏈上，則被反應(yīng)體系內(nèi)的ATP雙磷酸酶降解，不產(chǎn)生熒光，目前該方法已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適合于高通量SNP的檢測(cè)。

8　SNP檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)

一個(gè)理想的檢測(cè)SNP的方法必須具備以下優(yōu)點(diǎn):①適合自動(dòng)化操作，簡(jiǎn)便、迅速;②分析費(fèi)用低，特殊試劑用量少;③即使不純的樣品也可得到可靠的結(jié)果;④數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化分析;⑤反應(yīng)的通量要大而靈活，一天可以完成幾百到上百萬(wàn)個(gè)樣品。目前報(bào)道的SNP檢測(cè)方法中，盡管有些方法成本低，但速度慢，且不適合自動(dòng)化分析;有些方法可自動(dòng)化高通量分析，但制備探針成本高，準(zhǔn)確性低。到現(xiàn)在還沒(méi)有一個(gè)符合以上條件的理想方法出現(xiàn)，但根據(jù)樣品的實(shí)際情況，可以選擇出較合適方法。

綜上，靈敏準(zhǔn)確、高通量、簡(jiǎn)便易行的全基因組掃描分析方法對(duì)SNP的檢測(cè)特別重要，是未來(lái)SNP檢測(cè)的發(fā)展方向。目前的各種分析方法是通過(guò)發(fā)光、熒光、時(shí)間分辨熒光、熒光共振、熒光偏振、質(zhì)譜、電磁學(xué)性質(zhì)的探測(cè)使等位基因差異得以呈現(xiàn)，通過(guò)探針的設(shè)計(jì)和標(biāo)記，研制光、熒光、電磁等探測(cè)SNP的儀器設(shè)備是實(shí)現(xiàn)SNP高通量檢測(cè)的關(guān)鍵。理想的分析方法必須依賴(lài)生物化學(xué)、工程學(xué)和分析軟件的共同進(jìn)步。針對(duì)某些特異的基因片段改進(jìn)或綜合已有的方法，可研究建立進(jìn)行大規(guī)模高精度SNP檢測(cè)方法，如針對(duì)某些疾病設(shè)計(jì)的專(zhuān)一基因芯片等?？衫肧NP及其衍生物的理化性質(zhì)如光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)性質(zhì)探索新的方法。利用電學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，把寡核苷酸放在固相支持物的電極上，當(dāng)目標(biāo)序列和互補(bǔ)的探針結(jié)合時(shí)，其探針的電學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。用磁性標(biāo)記物可以用于放大檢測(cè)信號(hào)。隨著相關(guān)科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，有希望發(fā)展出一個(gè)理想的SNP檢測(cè)方法。

9　參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-17修回〕

(編輯安冉冉/杜娟)

基金項(xiàng)目:內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金杰青項(xiàng)目(2012JQ04) ;教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(212026) ;中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R394.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4720-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.146