張麗娥353000福建省南平市第二醫(yī)院

原位雜交檢測EBER中常見問題與對策

張麗娥
353000福建省南平市第二醫(yī)院

目的：EB病毒與許多腫瘤性疾病和非腫瘤性疾病相關(guān)，在臨床檢測中經(jīng)常應(yīng)用的檢測方法有原位雜交檢測法、免疫組化檢測法、電鏡檢測法。近年來，隨著科技的發(fā)展，在EB病毒檢測中，EBER原位雜交檢測方法已經(jīng)成為最主要的檢測方法，該方法具有很強(qiáng)的特異性和靈敏度，同時在使用的過程中也容易受到各種因素的影響。本文結(jié)合原位雜交檢測的應(yīng)用流程和失敗原因，對其常見問題進(jìn)行分析，并探討解決策略，以期為原位雜交檢測方法的有效運用提供一定的借鑒。

EBER原位雜交檢測；EBV病毒；問題；對策

EBER原位雜交技術(shù)在檢測Epstein-Barr病毒(EBV)時具有定位作用，能夠確定病毒與組織和細(xì)胞的關(guān)系，因此，在確定EBV與疾病關(guān)系時，EBER原位雜交已成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法[1]。初學(xué)者往往不容易成功，現(xiàn)對易出現(xiàn)失敗的原因進(jìn)行分析并介紹我們的一些體會。

EBER原位雜交檢測步驟

標(biāo)本與試劑：從臨床手術(shù)中切除的淋巴瘤組織中選取其中的一部分作為標(biāo)本。試劑盒選用EBER原位雜交試劑盒，其中包含EBER探針(地高辛標(biāo)記)、抗地高辛抗體(HRP標(biāo)記)、胃酶、DAB濃縮液等試劑。

標(biāo)本固定：標(biāo)本固定的目的是為了保持標(biāo)本組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，在最大程度上保證細(xì)胞內(nèi)核酸水平的穩(wěn)定性。標(biāo)本固定使用的材料一般使用緩沖馬爾福林，其溶液濃度10％，其最佳固定時間8～12 h。

切片制備：使用酒精對切片機(jī)進(jìn)行清洗，在清洗后的切片機(jī)上對組織進(jìn)行切片處理，切片的厚度3～4μm，將經(jīng)過切片處理之后的薄片黏附在經(jīng)過APES處理的載玻片上，之后將切片放在60～70℃的溫度下進(jìn)行烘烤，烘烤的時間＞60min。

組織常規(guī)脫蠟及水化：對切片組織進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化處理的目的是將內(nèi)源性過氧化物酶消除，將背景染色降低最小。其方法為使用濃度3％的甲醇H2O2在室溫下處理5min。

消化：對切片組織進(jìn)行消化處理的目的是提升組織的通透性，增強(qiáng)探針的穿透力，提升檢測方法的敏感性。使用的試劑為蛋白酶K，因為蛋白酶K相較于其他蛋白水解酶來說，在孵育時能夠?qū)崿F(xiàn)所有核酸酶的消化[2]。消化處理的流程是：將蛋白酶K與TBS按照1：25的比例進(jìn)行配置，消化處理5min，之后使用蒸餾水洗滌2min，使用100％無水乙醇Ⅰ和Ⅱ分別進(jìn)行2min的脫水處理，之后放置在空氣中進(jìn)行自然干燥。

雜交處理：在每張切片上滴加適量的探針雜交液，使用耐熱膜或者硅化蓋玻片對切片進(jìn)行覆蓋，將濕盒中的溫度控制在55℃左右，在其中進(jìn)行1 h孵育；如濕盒中的溫度為37℃，孵化時間＞3 h。孵化之后使用TBS溶液進(jìn)行沖洗，2min/次，共沖洗3次。之后在切片上滴加EBER一抗、A液和B液，孵育時間分別為60min、10min和10min，孵育完成后均使用TBS溶液進(jìn)行沖洗，2min/次，共沖洗3次。在沖洗之后，進(jìn)行DAB顯色和常規(guī)蘇木素復(fù)染，最后進(jìn)行封片處理。

失敗原因分析

失敗的原因主要有以下幾點：①消化環(huán)節(jié)：消化不足，使得核酸暴露不充分；消化過度，使得核酸周圍的蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，在后續(xù)步驟中導(dǎo)致核酸丟失，使得觀察目標(biāo)不清晰。②探針施加環(huán)節(jié)：在組織切片上加探針之前，組織切片未干透，探針施加失效。③雜交環(huán)節(jié)：在雜交環(huán)節(jié)，雜交液失效，或者雜交液的滴加量，雜交時間、雜交溫度控制失當(dāng)；在試驗過程中使用的緩沖液pH過低或者過高；一抗溶液或者二抗溶液被稀釋得過于嚴(yán)重，濃度過??；DAB失效。

EBER原位雜交檢測問題

雖然EBER原位雜交檢測的使用方法較為簡單，但對其結(jié)果產(chǎn)生影響的因素也較多，其中主要表現(xiàn)在以下幾個方面：標(biāo)本取樣不規(guī)范，所取得的腫瘤成分過少；組織固定不及時，固定液使用不規(guī)范，使得核酸組織受到破壞；在切片環(huán)節(jié)中，由于石蠟保留的年份過長或者操作失誤，影響切片質(zhì)量，影響雜交效果；在脫蠟環(huán)節(jié)脫蠟不徹底，消化失誤(不足或者過度)，探針質(zhì)量不佳，影響切片質(zhì)量；雜交、孵育的溫度和時間控制失誤，使得結(jié)果呈現(xiàn)出假陰性；探針質(zhì)量不佳使得雜交顯色定位不清，影響判斷；DAB沉渣附著不佳[3]，導(dǎo)致結(jié)果判讀失誤。

EBER原位雜交檢測對策

完善標(biāo)準(zhǔn)取樣：在進(jìn)行標(biāo)本取樣時，要控制樣本大小和腫瘤成分的多少，保證切片的完整性。

完善組織固定：在對組織進(jìn)行固定時，要使用規(guī)范的固定液，保證核酸的完整性。

組織消化：在對組織進(jìn)行消化時，若需要消化的組織量較大，要進(jìn)行分批消化[4]，嚴(yán)格控制消化時間。在消化的過程中，同一批組織滴加蛋白酶K的時間要＜30 s。

滴加探針：在滴加探針時，要注意探針的量，以組織大小為依據(jù)，一般情況下，每張切片滴加探針的量5～10μL[5]。在更換探針時，要對其進(jìn)行質(zhì)量控制，檢測新探針是否有效。

緩沖液配置：對于新配制的緩沖液，要進(jìn)行充分溶解混勻，在每次使用之前都要對其pH進(jìn)行測試，確定該溶液為中性緩沖液之后才能使用。

組織切片干燥處理：在進(jìn)行EBER原位雜交檢測之前要對組織切片進(jìn)行干燥處理，保證切片的干燥性，以免組織上的水分對探針產(chǎn)生稀釋作用，使得信號減弱或者使得信號不能有效地被表達(dá)出來。

抗體滴加：在對組織切片滴加抗體時，要把組織周邊的水分拭干，以免對抗體產(chǎn)生稀釋，在此過程中要保證組織不能干片。

樣本對照：為了保證每個檢測樣本均能被有效地判讀，要保證每一批EBER實驗樣本均有陽性樣本作為對照[6]。

小結(jié)

對于初學(xué)者而言，在檢測失敗的情況下，要善于分析，逐項排除可能導(dǎo)致失敗的原因。本實驗室EBER原位雜交曾因更換了探針和中性緩沖液，連續(xù)出現(xiàn)失敗，在確定操作步驟無誤的情況下，取陽性對照片兩張，以陽性探針、新探針做質(zhì)控，同時測試了新配制的緩沖液的pH，發(fā)現(xiàn)新配制的緩沖液未充分混勻，液體上段為強(qiáng)堿，下段為酸性，充分混勻后pH 7.0～7.5，再次進(jìn)行EBER原位雜交實驗，結(jié)果：兩張陽性對照片均呈陽性?？傊珽BER原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵重在細(xì)節(jié)，要排除任何可能導(dǎo)致雜交失敗的原因，以保證實驗的準(zhǔn)確性和成功性。

[1] 周小鴿,張小平,張勁松.EB病毒及其相關(guān)疾病[J].診斷病理學(xué)雜志,2001,8(1)：58-59.

[2] 周小鴿,劉勇.組織學(xué)技術(shù)的理論與實踐[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2010.

[3]林蓁.原位雜交檢測HPV與EBER中常見問題與對策[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2014,30(8)：928-930.

[4]李琳,田玉旺,朱紅艷.應(yīng)用EBER原位雜交檢測EB病毒的體會[J].診斷病理學(xué)雜志, 2011,18(4)：311-312.

[5] 崔錦珠.鼻咽癌患者EBER原位雜交檢測EB病毒的體會[J].中外女性健康,2014,11 (6)：98.

[6] 王俊生,孔紅.原位雜交檢測EB病毒的體會[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2014,36(2)：145-146.

Comm on problem s and counterm easures in EBER in situ hybridization detection

Zhang Lie
The Second HospitalofNanping City,Fujian Province 353000

EB virus is associated with many tumor and non neoplastic diseases,in clinical detection,themost commonly used detectionmethods are in situ hybridization detection,immunohistochemistry detection method,electronmicroscopic examination method.In recent years,with the development of science and technology,in the detection of EB virus,EBER in situ hybridization detection method has become themost important detection method,thismethod has a strong specificity and sensitivity,and it is also easy to be influenced by various factors in the process ofusing.This paper analyzes the common problems combined with the application process and the failure reason of in situ hybridization detection,explores solutions,in order to provide a reference for theeffectiveuseof in situ hybridization detectionmethod.

EBER in situ hybridization detection；EBV virus；Problem；Countermeasure

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.36.71