徐晶 蔡增林

有研究表明α-synuclein和帕金森?。≒D）有密切的關(guān)系。然而，α-synuclein在神經(jīng)元內(nèi)的降解方式仍然是有爭(zhēng)議的。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）以及自噬溶酶體途徑（ALP）（主要大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬CMA）是降解α-synuclein的兩種主要途徑。老化可以使UPS和ALP活性下降對(duì)神經(jīng)變性疾病具有重要的致病作用。這些主要的蛋白水解途徑的改變可能會(huì)導(dǎo)致α-synuclein由于清除受損而聚集。

相反地，α-synuclein的增加可能進(jìn)一步損害UPS或ALP。研究與水解途徑相關(guān)的調(diào)節(jié)因素對(duì)治療PD和相關(guān)α-synuclein病具有重要作用。

1 α-synuclein 的主要降解通路

1.1 泛素-蛋白泛素酶體系統(tǒng)（UPS）UPS主要降解短壽蛋白質(zhì)，包括兩個(gè)不同的和連續(xù)的步驟。第一步驟高度保守的76個(gè)氨基酸殘基泛素與表面暴露的賴氨酸殘基底物蛋白共價(jià)附著，泛素化是通過(guò)三個(gè)的級(jí)聯(lián)步驟，分別通過(guò)泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）催化完成。泛素與底物結(jié)合以后，通過(guò)連續(xù)地向底物轉(zhuǎn)移泛素分子產(chǎn)生多聚泛素鏈[1-3]。在第二步驟中，UPS的蛋白水解核心26S蛋白酶體復(fù)合物識(shí)別多聚泛素鏈，并將底物降解游離寡肽和可重復(fù)使用的泛素。泛素分子的轉(zhuǎn)移是由泛素循環(huán)的酶介導(dǎo)的[4]。26S蛋白酶體包括兩個(gè)多聚蛋白復(fù)合物，起水解作用的20S桶狀核心顆粒及具有調(diào)節(jié)功能的兩個(gè)19S顆粒[5-7]。蛋白酶體調(diào)節(jié)由19S復(fù)合物的ATP酶亞基嚴(yán)密控制[8]。

1.2 自噬溶酶體途徑（ALP）ALP主要降解長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)及廢棄細(xì)胞器。在溶酶體，細(xì)胞質(zhì)組分的降解通過(guò)三個(gè)亞型自噬途徑實(shí)現(xiàn)：小自噬、大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）。小自噬的細(xì)胞成分（包括細(xì)胞器、脂類或蛋白質(zhì)）是通過(guò)內(nèi)陷在溶酶體膜進(jìn)入囊泡完成。大自噬由3個(gè)連續(xù)的步驟：（1）形成的自噬泡AV，其中包括起始、成核、貨物識(shí)別、擴(kuò)展和完成；（2）成熟、運(yùn)輸、AV和溶酶體融合；（3）溶酶體蛋白酶降解。CMA是高度選擇性的機(jī)制，細(xì)胞質(zhì)蛋白識(shí)別特定的的五肽基序KFERQ或由伴侶和共伴侶分子復(fù)合物[9]。接著，它們被易位到溶酶體膜，并與溶酶體膜上蛋白復(fù)合物溶酶體相關(guān)膜蛋白2A型（LAMP-2A）結(jié)合，最后進(jìn)入溶酶體從而降解[10]。

1.3 α-synuclein降解的主要通路 有越來(lái)越多的有關(guān)α-synuclein的降解的研究，目前對(duì)降解α-synuclein確切機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。在體外分離的純化的體系中，UPS和ALP都能夠降解重組α-synuclein[11-12]。然而，α-synuclein將由UPS或ALP降解目前仍然令人費(fèi)解。PD遺傳相關(guān)的基因編碼的Parkin和UCH-L1蛋白與UPS相關(guān)[13-14]。很多分子、細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，這些基因與UPS清除α-synuclein有關(guān)，提示了在帕金森病中，UPS對(duì)降解α-synuclein具有關(guān)鍵作用[15-16]。初始研究表明，在某些情況下，α-synuclein以多泛素化的形式存在，在抑制蛋白酶體的神經(jīng)元細(xì)胞積累，這表明在UPS負(fù)責(zé)α-synuclein降解[17]。隨后在神經(jīng)細(xì)胞中研究表明，蛋白酶體可降解非泛素化α-synuclein[18]。Machiya等[19]研究α-synuclein在Ser129位點(diǎn)磷酸化可迅速通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，表明路易小體中Ser129位點(diǎn)磷酸化的α-synuclein可由UPS通路降解，在這項(xiàng)研究中，通過(guò)抑制蛋白酶體，只有磷酸化的而不是所有非折疊的α-synuclein都由UPS降解。

其他的研究，通過(guò)抑制蛋白酶體，都沒(méi)有檢測(cè)到內(nèi)生及過(guò)表達(dá)的α-synuclein的聚集[20]。因?yàn)棣?synuclein的寡聚形式只能由ALP但不是由UPS被清除[21]。CHIP（HSP70的C末端相互作用蛋白）作為一個(gè)決定起始分子參與UPS和ALP途徑，可與人受試者中路易小體中的α-synuclein和熱休克蛋白共定位[22]。同樣，證實(shí)蛋白水解酶抑制劑的存在，由E3泛素連接酶SIAH導(dǎo)致的單泛素化α-synuclein的聚集和形成的有毒物體顯著增加[23]，有報(bào)道指出，去泛素酶USP9X在體內(nèi)和體外都可以與α-synuclein相互作用并使其去泛素化。Ruth等[24]研究發(fā)現(xiàn)，USP9X調(diào)節(jié)α-synuclein的蛋白酶體和自噬系統(tǒng)降解更支持后者。在沒(méi)有蛋白酶水解損害時(shí)，單泛素化的底物蛋白多由UPS降解，而去泛素化的底物蛋白幾乎完全由ALP降解。在路易體癡呆（DLB）和PD患者的黑質(zhì)組織中USP9X胞質(zhì)水平減少，表明去泛素活性減低，在路易小體中單泛素化α-synuclein的聚集[24]。Tofaris等[25]也研究表明，E3連接酶Nedd4經(jīng)由內(nèi)體途徑參與α-synuclein的降解，并推測(cè)此途徑特異降解蛋白膜相關(guān)α-synuclein，而自噬降解寡聚形式的α-synuclein。體內(nèi)研究支持UPS參與α-synuclein的降解，表明去除26S的Psmc1亞基有條件在黑質(zhì)或前腦去除蛋白酶，導(dǎo)致神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)LB狀包體泛素化免疫反應(yīng)的和α-synuclein聚集和廣泛的神經(jīng)退行性疾病。這表明UPS是α-synuclein蛋白水解的重要途徑[26]。最近，研究表明在活鼠的大腦退化中，UPS和ALP對(duì)于α-synuclein的降解具有不同的作用。用UPS及ALP的藥物抑制劑及在不同的α-synuclein轉(zhuǎn)基因鼠模型中的多光子成像研究表明，降解α-synuclein途徑依賴于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的聚集。UPS在正常條件下降解α-synuclein，而ALP在α-synuclein水平升高的病理?xiàng)l件下起作用。推測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-synuclein水平的調(diào)節(jié)UPS及ALP降解途徑之間的關(guān)系[27]。

降解α-synuclein一個(gè)最主要的途徑是通過(guò)CMA與大自噬的溶酶體途徑，自噬溶酶體途徑的缺陷可以導(dǎo)致帕金森病發(fā)生。Rubinsztein研究發(fā)現(xiàn)，α-synuclein位于神經(jīng)元溶酶體內(nèi)，通過(guò)使用大自噬抑制劑可以減少與PD相關(guān)基因突變的α-synuclein而不是野生型α-synuclein[25]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)bafilomycin抑制溶酶體導(dǎo)致了可溶性低聚，而不是泛素化α-synuclein及過(guò)表達(dá)的野生型α-synuclein的原纖維形式在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)聚集[28]。大自噬對(duì)一些物種中α-synuclein的降解具有重要作用，誘導(dǎo)大自噬的可能對(duì)治療帕金森病具有重要意義。最近的研究發(fā)現(xiàn)生理?xiàng)l件下α-synuclein以四聚體形式存在減少了其聚集傾向，而與PD有關(guān)的（A30P、E46K和A53T）顯著降低了四聚體的穩(wěn)定性和增加了α-synuclein單體[29]。

2 α-synuclein對(duì)蛋白降解系統(tǒng)的影響

此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在α-synuclein疾病模型中溶酶體功能障礙，包括大自噬以及CMA缺陷，以自噬泡數(shù)量的增加為特征[30]。此外，帕金森病的另一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素是老齡化，α-synuclein的蛋白質(zhì)含量在老年人黑質(zhì)中顯著升高，而UPS和ALP活性隨年齡增長(zhǎng)均降低[31]，表明了老齡化在疾病進(jìn)展過(guò)程中，可導(dǎo)致蛋白水解系統(tǒng)障礙。在細(xì)胞內(nèi)降解途徑的缺陷是α-synuclein疾病的的主要原因，通過(guò)異常聚集α-synuclein導(dǎo)致的降解途徑的缺陷還有待研究。

2.1 α-synuclein導(dǎo)致UPS功能障礙 在體外，無(wú)論是在純化的蛋白質(zhì)或在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，都表明突變或野生型α-synuclein的表達(dá)，特別是可溶性寡聚體和聚集體的構(gòu)象，抑制20S或26S蛋白酶體的活性[32]。為了探索α-synuclein影響蛋白酶功能的作用機(jī)制，了解α-synuclein的特性在研究UPS功能障礙具有重要作用[33]。有研究結(jié)果表明，特定低聚α-synuclein可能通過(guò)相互作用功能靶向損害26S蛋白酶體[33]。此外，從150 kDa到450 kDa的少量α-synuclein，以及單體的或重組的α-synuclein，可以特異性與26S蛋白酶體作用。到目前為止，α-synuclein和26S蛋白酶體之間的相互作用仍有待研究。一種可能性是α-synuclein低聚體與20Sβ亞基的活性位點(diǎn)的直接結(jié)合[34]，雖然這低聚體將通過(guò)一個(gè)狹窄的開(kāi)放-門控通道易位。另外，α-synuclein低聚體可以與19S結(jié)合，使UPS通路障礙。α-synuclein低聚體與19S結(jié)合，將導(dǎo)致19S功能異常?；蛘?，α-synuclein寡聚體誘導(dǎo)空間構(gòu)想改變，抑制與蛋白酶體與其他底物的進(jìn)一步相互作用。低聚物與蛋白酶體功能障礙有關(guān)，并選擇性地被蛋白酶體降解[35]。

2.2 α-synuclein導(dǎo)致ALP功能障礙 在一些細(xì)胞和動(dòng)物模型研究中，胞質(zhì)α-synuclein的聚集與大自噬和CMA功能障礙有關(guān)[36]。之前有研究表明，在PC12細(xì)胞中，A53T突變?chǔ)?synuclein誘導(dǎo)自噬泡聚集，在這些細(xì)胞中溶酶體酸化顯著降低[37]。還有文獻(xiàn)[32]報(bào)道，僅野生型α-synuclein單體和二聚體，但不是寡聚體，通過(guò)CMA被降解，而氧化的和硝化蛋白通過(guò)CMA降解受抑制。相反，磷酸化和多巴胺修飾蛋白幾乎完全阻止了CMA依賴性降解[38]。另外，Rubinsztein研究表明野生型α-synuclein通過(guò)與Rab1a的相互作用，可以抑制早期自噬體形成。除了α-synuclein異常間接誘導(dǎo)大自噬及CMA障礙也可通過(guò)CMA依賴的蛋白直接破壞導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙而死亡[38]。總之，病理α-synuclein與自噬溶酶體途徑之間有相互關(guān)系，其具體機(jī)制還有待被研究。

在特發(fā)性PD和相關(guān)α-synuclein病發(fā)病的主要因素是α-synuclein的聚集，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，降解減弱，或特定的翻譯后的改變都可使其聚集并具有毒性。α-synuclein的降解至今仍存有爭(zhēng)議。筆者推測(cè)，α-synuclein的降解可能與總蛋白負(fù)擔(dān)、α-synuclein蛋白聚集狀態(tài)、特定細(xì)胞類型的體內(nèi)平衡環(huán)境及致病過(guò)程各階段有關(guān)。α-synuclein和細(xì)胞內(nèi)蛋白水解系統(tǒng)通過(guò)自反饋相互作用導(dǎo)致神經(jīng)變性。通過(guò)對(duì)α-synuclein降解途徑的研究，可以為治療帕金森提供新的治療策略。

[1]Glickman M H，Aaron C.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway：destruction for the sake of construction[J].Physiol Rev，2002，82（2）：373-428.

[2] Layfield R，Tooth D，Landon M，et al.Purification of polyubiquitinated proteins by S5a-affinity chromatography[J].Proteomics，2001，1（6）：773-777.

[3] Gallastegui N，Groll M.The 26S proteasome：assembly and function of a destructive machine[J].Trends Biochem Sci，2010，35（11）：634-642.

[4] Ardley H C，Robinson P A.E3 ubiquitin ligases[J].Essays Biochem，2005，41（41）：15-30.

[5] Palacino J J，Dijana S，Goldberg M S，et al.Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient mice[J].J Biol Chem，2004，279（1）：18 614-18 622.

[6] Crews C M.Feeding the machine：mechanisms of proteasome-catalyzed degradation of ubiquitinated proteins[J].Curr Opin Chem Biol，2003，7（5）：534-539.

[7] Benaroudj N，Zwickl P，Seemuller E，et al.ATP hydrolysis by the proteasome regulatory complex PAN serves multiple functions in protein degradation[J].Molecular Cell，2003，11（1）：69-78.

[8] Demartino G N，Gillette T G.Proteasomes：machines for all reasons[J].Cell，2007，129（1）：659-662.

[9] Xilouri M，Stefanis L.Autophagy in the central nervous system：implications for neurodegenerative disorders[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2010，9（6）：701-719.

[10] Chiang H L，Terlecky S R，Plant C P，et al.A role for a 70-kilodalton heat shock protein in lysosomal degradation of intracellular proteins[J].Science（New York，N.Y.），1989，246（4928）：382-385.

[11] Liu C W，Corboy M J，DeMartino G N，et al.Endoproteolytic activity of the proteasome[J].Science（New York，N.Y.），2003，299（5605）：408-411.

[12] Cuervo A M，Stefanis L，F(xiàn)redenburg R，et al.Impaired degradation of mutant alpha-synuclein by chaperone-mediated autophagy[J].Science（New York，N.Y.），2004，305（5688）：1292-1295.

[13] Leroy E，Anastasopoulos D，Konitsiotis S，et al.Deletions in the Parkin gene and genetic heterogeneity in a Greek family with early onset Parkinson’s disease[J].Human Genetics，1998，103（4）：424-427.

[14] Maraganore D M，Lesnick T G，Elbaz A，et al.UCHL1 is a Parkinson's disease susceptibility gene[J].Ann Neurol，2004，55（4）：512-521.

[15] Shimura H，Schlossmacher M G，Hattori N，et al.Ubiquitination of a new form of alpha-synuclein by parkin from human brain：implications for Parkinson's disease[J].Science（New York，N.Y.），2001，293（5528）：263-269.

[16] Yichin L，Lara F，Lashuel H A，et al.The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect alpha-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility[J].Cell，2002，111（2）：209-218.

[17] Bennett M C，Bishop J F，Leng Y，et al.Degradation of alphasynuclein by proteasome[J].J Biol Chem，1999，274（48）：33 855-33 858.

[18] Nakajima T，Takauchi S，Ohara K，et al.Alpha-synuclein-positive structures induced in leupeptin-infused rats[J].Brain Res，2005，1040（1-2）：73-80.

[19] Machiya Y，Hara S，Arawaka S，et al.Phosphorylated alphasynuclein at Ser-129 is targeted to the proteasome pathway in a ubiquitin-independent manner[J].J Biol Chem，2010，285（52）：40 732-40 744.

[20] Rideout H J，Stefanis L.Proteasomal inhibition-induced inclusion formation and death in cortical neurons require transcription and ubiquitination[J].Mol Cell Neurosci，2002，21（2）：223-238.

[21] Lee H J，Khoshaghideh F，Patel S，et al.Clearance of alphasynuclein oligomeric intermediates via the lysosomal degradation pathway[J].J Neurosci，2004，24（8）：1888-1896.

[22] Shin Y，Klucken J，Patterson C，et al.The co-chaperone carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein （CHIP） mediates alphasynuclein degradation decisions between proteasomal and lysosomal pathways[J].J Biol Chem，2005，280（25）：23 727-23 734.

[23] Esti L，Allon E，Eyal A，et al.Ubiquitylation of synphilin-1 and alpha-synuclein by SIAH and its presence in cellular inclusions and Lewy bodies imply a role in Parkinson's disease[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（15）：5500-5505.

[24] Ruth R，Raymonde S，Joseph H，et al.α-Synuclein fate is determined by USP9X-regulated monoubiquitination[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（108）：18 666-18 671.

[25] Tofaris G K，Kim H T，Hourez R，et al.Ubiquitin ligase Nedd4 promotes alpha-synuclein degradation by the endosomal-lysosomal pathway[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（41）：17 004-17 009.

[26] Bedford L，Hay D，Devoy A，et al.Depletion of 26S proteasomes in mouse brain neurons causes neurodegeneration and Lewy-like inclusions resembling human pale bodies[J].J Neurosci，2008，28（33）：8189-8198.

[27] Ebrahimi-Fakhari D，Cantuti-Castelvetri I，Rockenstein E，et al.Distinct roles in vivo for the ubiquitin-proteasome system and the autophagy-lysosomal pathway in the degradation of alphasynuclein[J].J Neurosci，2011，31（41）：14 508-14 520.

[28] He-Jin L，F(xiàn)arnaz K，Smita P，et al.Clearance of alpha-synuclein oligomeric intermediates via the lysosomal degradation pathway[J].J Neurosci，2004，24（8）：1888-1896.

[29] Wang W，Perovic I，Chittuluru J，et al.A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（43）：17 797-17 802.

[30] Xilouri M，Stefanis L.Autophagic pathways in Parkinson disease and related disorders[J].Expert Rev Mol Med，2011，13（5）：685-690.

[31] Ward W F.Protein degradation in the aging organism[J].Prog Mol Subcell Biol，2002，29（1）：35-42.

[32] Stefanis L，Larsen K E，Rideout H J，et al.Expression of A53T mutant but not wild-type alpha-synuclein in PC12 cells induces alterations of the ubiquitin-dependent degradation system，loss of dopamine release，and autophagic cell death[J].J Neurosci，2001，21（24）：9549-9560.

[33] Emmanouilidou E，Stefanis L，Vekrellis K.Cell-produced alpha-synuclein oligomers are targeted to，and impair，the 26S proteasome[J].Neurobiol Aging，2010，31（6）：953-968.

[34] Pickart C M，Cohen R E.Proteasomes and their kin：proteases in the machine age[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5（3）：177-187.

[35] Spencer B，Potkar R M.Beclin 1 gene transfer activates autophagy and ameliorates the neurodegenerative pathology in alpha-synuclein models of Parkinson's and Lewy body diseases[J].J Neurosci，2009，29（43）：13 578-13 588.

[36] Cuervo A M，Wong E S P，Martinez-Vicente M.Protein degradation，aggregation，and misfolding[J].Mov Disord，2010，25（S1）：S49-S54.

[37] Martinez-Vicente M，Talloczy Z，Kaushik S，et al.Dopaminemodified alpha-synuclein blocks chaperone-mediated autophagy[J].J Clin Invest，2008，118（2）：777-788.

[38] Yang Q，She H，Gearing M，et al.Regulation of neuronal survival factor MEF2D by chaperone-mediated autophagy[J].Science（New York，N.Y.），2009，323（5910）：124-127.