尤冬梅

天津市薊縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　301900

循環(huán)微小RNA的研究進(jìn)展

尤冬梅

天津市薊縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科301900

摘要微小RNA(microRNA,miR)在體液中可穩(wěn)定存在，其表達(dá)譜和表達(dá)量的變化與腫瘤、心腦血管疾病、免疫性疾病等多種疾病相關(guān)，可以作為疾病診斷、病理分型、預(yù)后判斷以及個(gè)體化治療的生物標(biāo)志分子。miR的檢測(cè)手段和檢驗(yàn)流程還需要標(biāo)準(zhǔn)化，以保證檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，達(dá)到較好的檢驗(yàn)靈敏度、特異度和重復(fù)性。已有部分miR表達(dá)譜被證實(shí)可以作為各種惡性疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，有望應(yīng)用于常規(guī)臨床疾病診斷。

關(guān)鍵詞微小RNA

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的內(nèi)源性小RNA,在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化、凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可從細(xì)胞內(nèi)釋放,廣泛而穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外液,統(tǒng)稱為循環(huán)miRNAs。miR自身表達(dá)具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。研究表明，miR幾乎參與了所有生命活動(dòng)，包括細(xì)胞發(fā)育、造血、脂肪代謝、器官生成、凋亡和細(xì)胞增殖。miR既可作為抑癌基因下調(diào)原癌基因活性也可作為癌基因下調(diào)抑癌基因活性，還可調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，其自身突變、缺失、易位及相互調(diào)控異常等還可導(dǎo)致相關(guān)基因異常表達(dá)[1]。自被發(fā)現(xiàn)以來，miR一直是近20年，尤其是近5年來生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)界的明星分子[2]。本文對(duì)miR的特點(diǎn)及作為疾病診斷標(biāo)志物的研究應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1miR的特點(diǎn)與功能

miR具有調(diào)控細(xì)胞周期、分化細(xì)胞等基本功能，并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)表明，超過60%的人類蛋白編碼基因至少受1個(gè)miR的調(diào)控[4]。miR與靶mRNA序列完全或幾乎完全配對(duì)時(shí)，引起靶mRNA降解；而不完全配對(duì)時(shí)，則抑制靶基因翻譯[5]。除了上述作用模式，后續(xù)研究表明，miR也可以和靶mRNA的任何互補(bǔ)序列結(jié)合，并發(fā)揮其調(diào)控作用。除了抑制靶mRNA的功能，miR也能作用于啟動(dòng)子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，甚至隨著細(xì)胞周期的改變，miR的功能可以在抑制轉(zhuǎn)錄和激活轉(zhuǎn)錄間進(jìn)行切換[6]。miR表達(dá)(譜)發(fā)生改變通常與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR不同的表達(dá)譜，甚至是單個(gè)miR的改變都可能成為輔助疾病早期診斷、分類、預(yù)后和預(yù)測(cè)的指標(biāo)。盡管目前報(bào)道的miR大部分源自于細(xì)胞內(nèi)的研究，研究者們?cè)诟鞣N體液中也發(fā)現(xiàn)越來越多的細(xì)胞外miR[7]。研究證實(shí)血清和血漿miR穩(wěn)定性較高，在4℃保存、室溫保存、反復(fù)凍融、長(zhǎng)期存儲(chǔ)，甚至是煮沸或酸堿處理情況下都可以保持穩(wěn)定[8]。目前認(rèn)為體液中miR常與蛋白質(zhì)等構(gòu)成復(fù)合物存在，因此具有良好的抗RNA酶降解能力，能穩(wěn)定地發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。miR可在血清和血漿等體液中穩(wěn)定存在，使得篩選循環(huán)miR作為疾病的新一代無創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物成為可能。

2篩選具有疾病診斷價(jià)值的miR的主要方法

由于miR在病理組織中常發(fā)生差異表達(dá)，并在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。因此，發(fā)現(xiàn)表達(dá)失調(diào)的miR是提出新的疾病診斷標(biāo)志物的主要思路。目前高通量篩選差異表達(dá)miR的方法主要為miR芯片(miRNA microarray)和MPSS(Massive parallel signature sequencing)兩種，兩者各有優(yōu)勢(shì)。miR芯片主要針對(duì)已知序列的miR基因進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，其可以較為敏感、精確地檢測(cè)已知miR的表達(dá)差異。MPSS主要用于miR組的主要成分以及其中富集表達(dá)的miR，及其在不同組織中的表達(dá)差異。通過檢測(cè)患者體液標(biāo)本中miR亦可實(shí)現(xiàn)疾病診斷的目的，而發(fā)現(xiàn)體液標(biāo)本中的miR通常只能通過MPSS檢測(cè)以獲得其序列以及拷貝數(shù)，隨后通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等低通量方法加以驗(yàn)證，這是目前發(fā)現(xiàn)體液中的miR以及明確其作為疾病診斷分子靶標(biāo)價(jià)值的主要思路和技術(shù)手段。

3循環(huán)miR在疾病診治中的臨床應(yīng)用

miR在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，可以作為疾病診斷、病理分型、預(yù)后判斷以及個(gè)體化治療的生物標(biāo)志分子，也是多種疾病基因治療的潛在靶點(diǎn)[10]。miR還可用于多種腫瘤預(yù)后的判斷以及藥物治療、放療和化療效果的預(yù)測(cè)[11]。

3.1腫瘤miR作為腫瘤標(biāo)志物用于臨床疾病的無創(chuàng)診斷預(yù)警在國(guó)內(nèi)外均備受關(guān)注。許多人類miR定位于基因組腫瘤相關(guān)區(qū)域或脆性位點(diǎn)，控制著細(xì)胞增殖、黏附、凋亡、血管形成等重要生物進(jìn)程。研究表明，多種腫瘤患者體內(nèi)均存在循環(huán)miR的異常變化，特異性循環(huán)miR表達(dá)變化可以提供多種疾病相關(guān)信息。如：早期診斷惡性腫瘤；區(qū)別原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤，輔助選擇合適治療方案[12]；用于腫瘤的病理分期；用于腫瘤病理分型(miR-205)在鱗癌中高表達(dá)，在輔助非小細(xì)胞肺癌的鱗癌和腺癌分型中具有很高的敏感度、特異性和重復(fù)性[13]。李雪峰等建立了一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-21的方法，探討其對(duì)乳腺癌診斷的應(yīng)用價(jià)值[14]，為開展腫瘤血清中miR-21診斷與預(yù)后研究提供了技術(shù)平臺(tái)。理想的循環(huán)miR標(biāo)志物在腫瘤患者外周血中呈中等或高水平表達(dá)，在健康人血漿中檢測(cè)不到或低水平存在[15]。

3.2心腦血管疾病miR參與多種心血管系統(tǒng)早期病理改變，缺血性心肌病、擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭以及主動(dòng)脈狹窄患者中均存在miR的差異表達(dá)。AMI急性期有多種心臟特異性miR表達(dá)異常，其中檢測(cè)miR-208a在血漿中升高的敏感度與心肌肌鈣蛋白I(cTnI)相當(dāng)，而miR-1的血漿水平與AMI的嚴(yán)重程度以及致死性心律失常密切相關(guān)，是反映疾病進(jìn)展和治療效果的新的血液標(biāo)志物。血漿miR-423-5p是慢性充血性心力衰竭患者較好的預(yù)測(cè)指標(biāo)[16]。

3.3免疫性疾病miR與機(jī)體的免疫功能存在著重要的聯(lián)系，miR通過影響免疫細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞亞群的分化及功能，參與機(jī)體固有免疫與獲得性免疫活動(dòng)，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，并與自身免疫性疾病的病理、生理密切相關(guān)。近年來研究人員在許多自身免疫性疾病中都找到異常表達(dá)的miR。Keller等[17]先研究miR在MS中的診斷效能，發(fā)現(xiàn)單個(gè)miR-145在所有異常表達(dá)的miR中具有最好的效能。多發(fā)性硬化癥患者PBMC中miR-18b、miR-599表達(dá)異常改變可能與疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)，而miR-96則可能在疾病緩解中發(fā)揮功能作用[18]，循環(huán)miR是對(duì)自身免疫性疾病診斷、預(yù)后判斷、疾病活動(dòng)度和嚴(yán)重程度評(píng)估都很有希望的非侵襲性候選標(biāo)志物。

3.4其他疾病miR是代謝活躍組織發(fā)育和維持的重要調(diào)節(jié)因子，miR的表達(dá)改變將導(dǎo)致糖和脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)受損。多個(gè)不同研究均發(fā)現(xiàn)妊娠婦女血漿中存在特異的miR，提示miR可能作為妊娠周期以及妊娠相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物。miR-526、miR-527能夠準(zhǔn)確診斷妊娠。血漿miR-122表達(dá)升高對(duì)于病毒、酒精以及化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷診斷價(jià)值較高，具有很好的敏感度和特異度。張霞等建立了SYBR Green I FQ-PCR檢測(cè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-202表達(dá)的方法，發(fā)現(xiàn)miR-202在多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者中表達(dá)普遍上調(diào)，與健康對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明miR-202與MM的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。

4miR的檢測(cè)方法及影響因素

循環(huán)miR的檢測(cè)方法主要包括：RNA印記分析法(Northern blot)、芯片方法、熒光定量PCR、液相單分子檢測(cè)、高通量測(cè)序、電化學(xué)檢測(cè)、生物發(fā)光檢測(cè)等。每種方法都不是很完美，都存在一定的內(nèi)缺陷，需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境選擇最合適的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有的大量研究結(jié)果采用了多種不同的研究平臺(tái)和定量方法。近期，國(guó)內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在這方面進(jìn)行了有效的探索，加快了循環(huán)miR檢測(cè)走向臨床的步伐。陳必成等建立了改良通用莖環(huán)引物法結(jié)合熒光定量PCR對(duì)miR進(jìn)行篩選和定量檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)莖環(huán)引物RT-PCR檢測(cè)相比，該方法快速、穩(wěn)定、靈敏、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)，提高了miR的篩選效率。

近年來，已有很多研究證明miR在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，因此，通過檢測(cè)miR的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)疾病的診斷、病理分型和預(yù)后判斷，以及作為疾病基因治療的潛在靶點(diǎn)，將展示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。miR可能成為疾病診斷新的生物學(xué)標(biāo)志，還可能使其成為藥靶，或是模擬這一分子進(jìn)行新藥開發(fā)，這將可能給人類疾病的治療提供一種新手段。相信隨著研究的不斷深入，miR檢測(cè)和研究將會(huì)為疾病診斷及預(yù)后判斷帶來新的發(fā)展。

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(編輯楊陽)

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收稿日期2014-11-18

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文章編號(hào)：1001-7585(2015)13-1722-03