蘇　蘭,楊　婧，唐映梅(綜述)，楊晉輝(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)

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核磁共振檢測血清代謝物組在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的應(yīng)用

蘇蘭△,楊婧，唐映梅(綜述)，楊晉輝※(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)

摘要：原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。臨床上很多患者的診斷仍主要靠肝組織活檢，迫切需要尋找更簡便可靠的診斷方法。應(yīng)用核磁共振(NMR)技術(shù)檢測PBC患者血清代謝物組，在近年來得到飛速發(fā)展。但該技術(shù)尚未成熟，目前未廣泛應(yīng)用于臨床。該文就代謝組學(xué)的概況、NMR檢測血清代謝物組的相關(guān)研究進(jìn)展及其在PBC診斷中的應(yīng)用予以綜述，為該技術(shù)應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化；核磁共振；血清代謝物組

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病，病因不清，調(diào)查顯示PBC的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，且該病預(yù)后不良，從出現(xiàn)癥狀到死亡或行肝移植的平均時(shí)間為5～10年[1]。根據(jù)美國肝臟病學(xué)會(huì)2009年修訂的PBC診療指南，目前PBC的診斷依據(jù)主要有：①血清生化檢查提示膽汁淤積，肝源性血清堿性磷酸酶升高和(或)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶升高；②抗線粒體抗體陽性；③病理學(xué)證據(jù):肝組織學(xué)活檢示非化膿性膽管炎和小葉間膽管梗阻，在排外其他原因引起的膽汁淤積后，具備以上3個(gè)條件中的2項(xiàng)即可診斷為PBC[2]。從以上標(biāo)準(zhǔn)可以看出，對(duì)于抗線粒體抗體陰性的患者，其最終確診不得不依賴肝臟病理分析，但其高風(fēng)險(xiǎn)性和有創(chuàng)性的特點(diǎn)限制了其在PBC診斷中的廣泛開展。所以，有必要重新尋找更簡單、可靠的疾病診斷標(biāo)志物?，F(xiàn)就核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)檢測血清代謝物組在PBC中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1代謝組學(xué)研究概況

代謝組學(xué)是在1999年，由Nicholson等[3]提出，并將其定義為以動(dòng)物的液體和組織為研究對(duì)象，研究生物體對(duì)病理生理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物質(zhì)質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化，關(guān)注的對(duì)象為相對(duì)分子質(zhì)量<1000的小分子化合物。Fiehn[4]將代謝組學(xué)按照研究目的不同分為4類：代謝物靶標(biāo)分析、代謝輪廓(譜)分析、代謝組學(xué)、代謝指紋分析。與傳統(tǒng)的代謝研究不同，代謝組學(xué)研究更為全面，其從整體上研究生物樣本中全部的代謝組分，目前已應(yīng)用于植物、分子表型、功能基因組學(xué)、藥物毒性、藥物療效、分子病理學(xué)及疾病的診斷等許多領(lǐng)域[5]。與較早出現(xiàn)的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。疾病導(dǎo)致機(jī)體病理生理變化過程，可引起代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)的改變，通過對(duì)正常人和患者的某些代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，可尋找疾病的生物標(biāo)志物，這將為疾病的診斷提供更好的方法。代謝組研究的一個(gè)重要部分是比較分析健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下小分子代謝物表達(dá)的差異，這有助于人們尋找各種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物，并可用于疾病預(yù)后及治療效果的評(píng)判。代謝組學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)在于：①代謝物是基因和蛋白表達(dá)放大，使檢測更容易；②基因及蛋白表達(dá)需要全基因組測序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫，而代謝組學(xué)不需要；③代謝物的種類遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)目，這在檢測上更簡便；④生物體液的代謝物分析可反映機(jī)體系統(tǒng)的生理或病理狀態(tài)；⑤不同生物體內(nèi)的代謝成分是一樣的，使代謝組學(xué)技術(shù)具有更好的通用性[6]。完整的代謝組學(xué)分析流程主要包括樣品采集及預(yù)處理、數(shù)據(jù)采集及預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、目標(biāo)物識(shí)別和研究結(jié)果的解釋與應(yīng)用等步驟，代謝組學(xué)研究最常用的樣本有尿液、血清或血漿[7]。研究中較常用的方法包括NMR、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：①NMR是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻而產(chǎn)生能躍遷的譜學(xué)技術(shù)；NMR技術(shù)對(duì)樣品的需要量少，幾乎不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，且NMR方法還能提供豐富的代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、濃度、分子動(dòng)力學(xué)及相互作用等分子信息；而NMR技術(shù)最大的不足在于靈敏度低、分辨率不高，隨著近年來技術(shù)的改進(jìn)，上述缺點(diǎn)將逐漸被改進(jìn)[8]；②氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)適宜分析小分子、熱穩(wěn)定、易揮發(fā)、能氣化的化合物，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用操作前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，衍生化預(yù)處理不僅費(fèi)時(shí)且其過程會(huì)丟失某些物質(zhì)的信號(hào)[9]；③液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可分析高極性、更高相對(duì)分子質(zhì)量及熱穩(wěn)定性差的化合物，超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種對(duì)分析復(fù)雜樣品很有效的方法[10]。與NMR相比，后兩種技術(shù)在操作、樣品要求及費(fèi)用上要求均較高。近年來，為實(shí)現(xiàn)各類代謝物的高分辨、高通量分離分析，在有關(guān)色譜分離模式的選擇、超高效/高壓液相色譜系統(tǒng)開發(fā)以及多維色譜技術(shù)等方面都開展了大量的研究。

2NMR在血清代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用

NMR是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級(jí)發(fā)生塞曼分裂，讓處于外磁場中的自旋核接受一定頻率的電磁波輻射，當(dāng)輻射的能量恰好等于自旋核兩種不同取向的能量差時(shí)，處于低能狀態(tài)的自旋核吸收電磁輻射能躍遷到高能狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱為NMR[11]。NMR于20世紀(jì)70年代初開始應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究，并于此后得到飛速發(fā)展。利用高分辨率NMR技術(shù)對(duì)完整器官或組織細(xì)胞內(nèi)許多微量代謝組分進(jìn)行檢測，可得到相應(yīng)的生物代謝信息。NMR方法的如下特點(diǎn)使其成為代謝組學(xué)中最為普遍研究手段：①對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)無損傷性；②能在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件更容易實(shí)現(xiàn)；③可研究化學(xué)交換、擴(kuò)散及內(nèi)部運(yùn)動(dòng)等動(dòng)力學(xué)過程，給出信息較豐富，且為動(dòng)態(tài)性；④可設(shè)計(jì)多種編輯手段，實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣[12]。樣品進(jìn)行NMR技術(shù)檢測前幾乎不需要進(jìn)行處理，操作過程快速，可使用極少量的樣本獲得大量信息。

目前常用的NMR技術(shù)有氫譜、碳譜及磷譜3種，因氫譜對(duì)含氫化合物均有響應(yīng)，能完成樣品中大多數(shù)化合物的檢測，滿足代謝組學(xué)中對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測的目標(biāo)，所以氫譜應(yīng)用最為廣泛。早期的工作主要應(yīng)用氫譜技術(shù)分析哺乳動(dòng)物的尿液和體液樣本。Tréhout等[13]采用高通量NMR技術(shù)，對(duì)缺血性肝衰竭導(dǎo)致肝性腦病的豬動(dòng)物模型進(jìn)行了生物人工肝支持系統(tǒng)治療前后的血漿代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)海藻鹽包被原代豬肝細(xì)胞生物人工肝治療的肝衰竭豬的血漿膽堿、氧化三甲胺峰值較僅進(jìn)行血漿置換治療組下降，生存時(shí)間也較長。Yang等[14]應(yīng)用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)氫譜技術(shù)對(duì)人肝細(xì)胞性肝癌進(jìn)行檢測，同時(shí)與正常肝組織對(duì)比，腫瘤組織中乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、胱氨酸、膽堿代謝物、磷酸乙醇胺等水平均明顯升高，而三酰甘油、葡萄糖、糖原等水平明顯下降；使用同樣的方法在非肝硬化組織、肝硬化組織及低分化腫瘤組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同疾病狀態(tài)下肝組織的代謝物也各有不同。Martínez-Granados等[15]采用高分辨力的磁共振波譜研究慢性肝炎引起的肝硬化患者離體肝活檢組織，結(jié)果提示，慢性肝炎引起的肝硬化患者離體肝活檢組織中谷氨酸、磷脂乙醇胺、磷酸膽堿、不飽和脂肪酸這4種代謝物較正常肝組織升高，而谷氨酰胺、天冬氨酸、游離膽堿和葡萄糖這4種代謝物則較正常低，并且發(fā)現(xiàn)谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖似乎與肝硬化分期相關(guān)。Yap等[16]在研究甲烯酸丙酯誘導(dǎo)的大鼠肝毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，用高分辨力的磁共振波譜對(duì)肝毒性大鼠的肝臟進(jìn)行測定，用氫譜對(duì)血漿和尿樣進(jìn)行測定，進(jìn)而通過主要成分分析法發(fā)現(xiàn)脂類成分在肝組織中含量明顯增高，這一結(jié)果與在血清中發(fā)現(xiàn)的脂類成分含量降低相吻合。

3代謝組學(xué)在PBC中的應(yīng)用

疾病的發(fā)生會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的代謝變化，通過代謝組學(xué)的研究，找出相關(guān)代謝標(biāo)志物并建立科學(xué)的診斷模型，對(duì)于疾病診斷和分型將提供許多幫助。2002年，Brindle等[17]首先報(bào)道了應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究心血管疾病患者的血清和血漿的NMR譜圖，并提出了判別心血管疾病及其嚴(yán)重程度的新診斷方法。肝臟是人體最主要的代謝器官，是三大物質(zhì)代謝的樞紐，肝臟如果有病理生理改變，與之相關(guān)的代謝就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，這時(shí)可以通過分析代謝產(chǎn)物成分，得到與肝臟病理生理過程相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)信息。代謝組學(xué)研究起步開始，就在肝病領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究。Robertson等[18]采用NMR和模式識(shí)別技術(shù)快速進(jìn)行肝腎內(nèi)毒性物質(zhì)的代謝組學(xué)評(píng)價(jià)，同時(shí)使用四氯化碳、α-奈基異硫氰酸鹽兩種化合物制造肝臟損傷模型，發(fā)現(xiàn)了不同時(shí)間點(diǎn)的代謝物譜特征，提出代謝物特征可預(yù)測肝損模型嚴(yán)重程度的觀點(diǎn)，并設(shè)想可作為預(yù)測指標(biāo)。Van等[19]曾對(duì)肝硬化患者的肺泡氣進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的呼氣中二甲硫醇以及部分酮體的水平明顯升高，且二戊酮的水平與肝臟損害的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Qi等[20]利用NMR方法分析肝硬化與肝癌細(xì)胞患者的血清代謝輪廓，得出了與上述相同的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)兩者的醋酸、丙酮酸等9種代謝物水平高于健康對(duì)照組，而低密度脂蛋白、異亮氨酸等7種代謝物水平低于對(duì)照組。連江山[21]利用線性梯度的超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，不同原因肝硬化患者血清中油酰胺和十四酰胺濃度的變化不同，這些脂肪酸酰胺在酒精性肝硬化患者血清濃度增加，但在乙型肝炎引起的肝硬化患者血清濃度降低。雖然各種原因引起的肝硬化病因不同，但均導(dǎo)致了彌漫性纖維化和再生結(jié)節(jié)的相同病理結(jié)局。PBC典型的病理改變可分為4期：膽管炎期、膽管增生期、纖維化期、肝硬化期，不同階段肝組織的病理改變必然會(huì)影響肝臟在機(jī)體新陳代謝中的作用。近年來，關(guān)于PBC代謝組學(xué)的研究仍較少，劉薇[22]運(yùn)用以液相色譜-質(zhì)譜為基礎(chǔ)的血液代謝組學(xué)研究方法對(duì)自身免疫性肝炎和PBC患者進(jìn)行了血液代謝組學(xué)的初步研究，通過研究其與正常人間的血液代謝譜差異，鑒定出了膽汁酸、溶血卵磷脂等5類生物標(biāo)志物。周豪[23]采用超快液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，建立以超快液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)研究平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)了三酰甘油、磷脂酰膽堿等21種PBC的生物標(biāo)志物。Trottier等[24]使用液相色譜法發(fā)現(xiàn)，PBC及原發(fā)性硬化性膽管炎患者的總膽汁酸、甘氨酸、牛磺酸均高于健康對(duì)照組。因此，盡管國內(nèi)外關(guān)于PBC代謝組學(xué)的研究仍較少，但借鑒上述不同類型肝硬化以及肝癌的代謝組學(xué)研究思路，向PBC代謝組學(xué)研究領(lǐng)域擴(kuò)展，相信其將為研究自身免疫性肝病發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新方法，為臨床診斷提供新的思路。

4小結(jié)

代謝組學(xué)作為一門新興的學(xué)科，其發(fā)展非常迅速。目前，代謝組學(xué)技術(shù)在PBC診斷的應(yīng)用研究尚處于初步階段。由于患病生物體內(nèi)的所有小分子代謝產(chǎn)物都可被檢測，提示可以尋找更多的可能生物標(biāo)志物達(dá)到早期診斷、早期治療的目的。NMR為非侵入操作，且不破壞樣本，是現(xiàn)有代謝組學(xué)分析技術(shù)中唯一能用于活體和原位研究的技術(shù)[25]。相信隨著分析手段和數(shù)據(jù)分析方式的不斷完善，NMR的代謝組學(xué)在PBC的診斷、治療以及預(yù)后判斷將發(fā)揮更廣泛的作用。

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Application of NMR in the Detection of Serum Metabolites Group of Primary Biliary CirrhosisSULan,YANGJing,TANGYing-mei,YANGJin-hui.(DepartmentofHepatology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanCenterfortheStudyofLiverDiseases,Kunming650031,China)

Abstract:Primary biliary cirrhosis(PBC) pathogenesis is not clear at present,and the diagnosis of many patients still mainly relies on liver biopsy,so there is an urgent need to find a more convenient and reliable diagnostic method.Using nuclear magnetic resonance (NMR) to detect serum metabolites group in patients with PBC is a rapid development in recent years,though the technology is not yet mature,and not widely used in clinical practice currently.Here is to make a review of metabolomics research progress related to serum metabolomic NMR and its application in the diagnosis of PBC to prepare for the clinical application of the technology.

Key words:Liver biliary cirrhosis； Nuclear magnetic resonance； Serum metabolites

收稿日期：2014-07-15修回日期：2014-10-12編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目聯(lián)合專項(xiàng)(2010CD170)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.045

中圖分類號(hào)：R575

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)11-2042-03