許秀洪，洪金妮(綜述)，周國平(審校)

(1.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸推拿科，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515)

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醫(yī)學影像學

激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)在腦卒中針刺機制中的應(yīng)用進展

許秀洪1△，洪金妮2(綜述)，周國平1※(審校)

(1.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸推拿科，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515)

摘要：激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)作為一種非侵入性圖像分析儀器，有標本制備簡單、分辨率高、實時動態(tài)成像等特點，可清晰地對活體細胞進行無損傷性動態(tài)觀察、空間定位、定量檢測等。針刺療法治療腦卒中具有良好的臨床療效，其機制研究也越來越受到重視。CLSM作為新一代的研究工具，也廣泛應(yīng)用于針刺機制的基礎(chǔ)研究中，該文就CLSM技術(shù)在腦卒中針刺機制研究中的應(yīng)用情況予以綜述。

關(guān)鍵詞:腦卒中；激光共聚焦掃描顯微鏡；針刺

激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)是20世紀末推出的高精度醫(yī)學圖像分析儀器，CLSM是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上，集普通光學顯微鏡、激光、電子、計算機技術(shù)和圖像處理技術(shù)于一體的現(xiàn)代高科技產(chǎn)品，與傳統(tǒng)光學顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡分辨率高，在實現(xiàn)多重熒光觀察的同時形成清晰的三維圖像，在生命科學中被譽為“細胞CT”。祖國醫(yī)學的針刺治療，在腦卒中的治療中具有良好的臨床療效，運用各種現(xiàn)代先進的科學技術(shù)，研究針刺治療腦卒中機制，已成為針刺機制研究的重要途徑，CLSM就是采用的先進設(shè)備之一。現(xiàn)就近年來CLSM技術(shù)在針刺治療腦卒中研究中的應(yīng)用情況予以綜述。

1CLSM的基本原理和應(yīng)用

1.1CLSM的基本原理CLSM以激光作為光源，激光通過針孔聚焦到達樣本的某深度，形成一個點光源，點光源對樣本內(nèi)聚焦平面上的每一個點進行掃描，樣本上的被照射點在檢測針孔上達到成像平面，由倍增管在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。光源針孔與檢測針孔的位置相對于焦平面是共軛的，聚焦平面上的點同時聚焦于光源針孔和檢測針孔，聚焦平面以外的點不會在檢測針孔中成像，這樣得到的共聚焦圖像是樣本的光學橫斷面，得到的是高清晰度、高分辨率的圖像，同時激光可以調(diào)節(jié)聚焦的深度，可進行X、Y、Z三軸的掃描，將這些軸上形成的圖像經(jīng)過計算機軟件分析重建后，可獲得該樣本任意平面的圖像或者三維立體圖[1]。

1.2CLSM在醫(yī)學研究中的應(yīng)用CLSM在各種免疫熒光探針、染料的輔助下，與被檢測物質(zhì)特異性結(jié)合后可觀察到固定的生物細胞組織切片，活體細胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子的動態(tài)變化。在生命科學領(lǐng)域的中常應(yīng)用于：①細胞組織內(nèi)生物大分子的原位鑒定，細胞及亞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，如在細胞原位檢測核酸、蛋白質(zhì)、抗體及其他分子；檢測細胞凋亡、細胞器、細胞融合、細胞骨架、細胞間縫隙連接通訊等。②活體細胞或組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測，如實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+、pH、活性氧物種的產(chǎn)生及膜電位的變化等[2-4]。

2CLSM在針刺治療腦卒中研究中的應(yīng)用

2.1組織、細胞與亞細胞的觀察CLSM不僅簡化了傳統(tǒng)光鏡的研究程序，同時可精確聚焦到較厚的切片甚至是組織的深部，莊明華等[5]和白曄等[6]運用CLSM觀察在正常狀態(tài)下活體家兔大腦皮質(zhì)內(nèi)血管內(nèi)的軸流、緣流厚度和血管口徑的變化，隨后作針刺處理，再進行生理狀態(tài)下和針刺后的對比，結(jié)果表明電針刺激能引起家兔動脈的舒縮運動，其舒縮運動的結(jié)果隨著血管口徑大小的不同而有所差別，證明針刺可改變大腦循環(huán)血流量，通過微循環(huán)的改善進而增加缺血腦組織能量供應(yīng)，改善缺血后組織細胞的代謝，減輕腦組織細胞的損傷。張金鈴等[7]采用D-273內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光分子探針，通過CLSM動態(tài)掃描觀察，對比加入正常大鼠血清和電針2周后大鼠的血清，發(fā)現(xiàn)針刺2周后的血清能抑制神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性的下調(diào)。

楊福霞[8]運用攜帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標記的反轉(zhuǎn)錄病毒pLXSN，利用CLSM觀察大鼠缺血部位側(cè)腦室下區(qū)EGFP細胞和EGFP/巢蛋白雙標細胞的表達、缺血處海馬齒狀回EGFP陽性細胞和EGFP/神經(jīng)特異性烯醇化酶雙標細胞的表達。觀察并計算其實驗結(jié)果后表明針刺任脈能促進缺血大鼠神經(jīng)干細胞的分化與增殖。刁利紅等[9]在電針刺激任脈和肌內(nèi)注射堿性成纖維細胞生長因子的實驗中，利用CLSM觀測局灶性缺血模型大鼠原位神經(jīng)干細胞增殖情況，也得出針刺可促進大鼠腦缺血后神經(jīng)干細胞的增殖。

于海波等[10]利用CLSM觀察電針任脈腧穴對于局灶性腦缺血大鼠損傷側(cè)海馬星形膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)歸是否有正向影響的實驗中，觀察大鼠損傷側(cè)海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性細胞以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白/神經(jīng)元特異性烯醇化酶雙標陽性細胞的形態(tài)和數(shù)量后得出：電針刺激任脈可調(diào)節(jié)缺血后大鼠海馬增殖的星形膠質(zhì)細胞，抑制其過度增殖，促進它的多潛能化，有利于腦缺血后的神經(jīng)修復，這一結(jié)果與Lin和Matesic[11]的實驗結(jié)果相符。羅燕等[12]運用CLSM觀察大鼠皮質(zhì)缺血灶周圍區(qū)不同時間段星形膠質(zhì)細胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫活性反應(yīng)的變化發(fā)現(xiàn)，電針可減輕缺血引起的星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)性損傷,下調(diào)膠質(zhì)細胞內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的過度表達，推斷電針改善腦缺血的作用可能與其干預星形膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)有關(guān)。

2.2Ca2+水平的測定Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，是細胞接受外界刺激或生物活性物質(zhì)作用后引起生物學反應(yīng)的重要橋梁，有學者利用CLSM技術(shù)和活體腦片負載技術(shù),研究局灶性腦缺血和缺血/再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)Ca2+變化及針刺調(diào)節(jié)Ca2+的變化，發(fā)現(xiàn)急性局灶性腦缺血和缺血/再灌注后大鼠海馬錐體細胞Ca2+隨著時間的延長呈增高趨勢，在再灌注6 h后胞內(nèi)Ca2+達到高峰，此后有下降趨勢，但仍高于缺血前水平，驗證了臨床上腦缺血在6 h的有效時間窗內(nèi)采取多方面多水平的干預措施，對腦損傷的歸轉(zhuǎn)至關(guān)重要。也證實了針刺降低缺血區(qū)海馬CA1區(qū)錐體細胞內(nèi)Ca2+,抑制了鈣超載，從而保護腦缺血后神經(jīng)元的損傷[13-16]。杜亦旭[17]通過CLSM觀察發(fā)現(xiàn)電針刺激可降低缺血后皮質(zhì)和紋狀體細胞內(nèi)Ca2+水平，抑制缺血引起的星形膠質(zhì)細胞鈣超載，促進星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元間的信息傳遞，使其逐步恢復協(xié)調(diào)，從而有助于減輕腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)元的損傷。

張金鈴等[18]從血清學和細胞學角度，取海馬細胞進行原代培養(yǎng)后應(yīng)用鈣熒光分子探針Fluo-3 AM染色，運用CLSM動態(tài)掃描，觀察加入正常大鼠血清和電針2周后的血清對海馬細胞內(nèi)Ca2+的影響。結(jié)果表明，加入針刺血清可降低升高的細胞內(nèi)Ca2+水平。黃長軍等[19]采用CLSM和分子探針技術(shù)，對針刺通過顱腦損傷大鼠血清影響SY5Y細胞Ca2+進行研究。同樣得出電針可減慢腦損傷大鼠腦組織Ca2+水平的上升趨勢、抑制細胞內(nèi)Ca2+滯留和超載的結(jié)論。

2.3信號通路的研究陳小娛[20]用CLSM對免疫熒光雙標的缺血腦片進行雙通道斷層掃描,觀察腦缺血/再灌注24 h后大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶3(caspase-3)陽性細胞熒光強度的變化。雙通道掃描圖像重疊后顯示，caspase-3主要在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)表達，在細胞核有少量的表達，電針組中caspase-3陽性細胞的平均熒光強度較腦缺血/再灌注組中的明顯下降,較對照組中的平均熒光強度強，提示針刺治療可有效下調(diào)caspase-3的表達，抑制細胞凋亡的發(fā)生。羅文舒等[21]通過CLSM觀察針刺督脈經(jīng)穴對局灶性腦缺血大鼠腦組織核因子κB 蛋白表達的影響，結(jié)果表明針刺督脈經(jīng)穴抑制腦缺血/再灌注大鼠急性期核因子κB的過度表達，減少細胞凋亡，減少炎癥反應(yīng)，改善腦缺血/再灌注損傷。孫寧[22]應(yīng)用整體腦缺血/再灌注模型，對N-甲基-D-天冬氨酸受體和酪氨酸激酶受體在針刺治療腦缺血/再灌注損傷中的作用以及兩者之間的相互關(guān)系進行探討。電針治療后應(yīng)用免疫熒光標記技術(shù)，CLSM下觀察電針治療對缺血區(qū)大腦皮質(zhì)酪氨酸激酶表達的影響。結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注損傷后，電針治療可以上調(diào)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)酪氨酸激酶受體的表達，同時，也可抑制缺血損傷誘導的N-甲基-D-天冬氨酸受體亞單位NR1的異常表達，電針的神經(jīng)保護效應(yīng)可能通過酪氨酸激酶-磷脂酰肌醇3-激酶通路介導，通過該信號通路增強負性轉(zhuǎn)錄因子NRSF與N-甲基-D-天冬氨酸受體NR1亞單位基因的結(jié)合能力，從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制NR1的表達。劉榮[23]對JAKs激酶在電針抗缺血性腦損傷中作用的研究，采用免疫熒光染色法結(jié)合CLSM，觀察電針對局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)不同時間段缺血側(cè)皮質(zhì)JAKs激酶及其轉(zhuǎn)錄激活因子的影響，表明電針治療的介入能顯著提高腦缺血早期缺血側(cè)皮質(zhì)JAK1的活性,激發(fā)機體自我保護機制，減輕腦缺血損傷，且能促使這種保護性的效應(yīng)維持一段較長的時間,參與受損組織的修復。

3小結(jié)

CLSM的應(yīng)用開創(chuàng)了細胞生物學更深層次的研究，作為一項強有力的研究工具與技術(shù)，能更精準地從腦組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學、離子濃度變化、信號因子等方面來研究針刺抗腦卒中發(fā)展的可能性機制。針刺抗腦細胞凋亡方面的研究是近來研究的熱點，其機制是一個龐大而復雜的網(wǎng)狀關(guān)系[24-25]。隨著CLSM技術(shù)的應(yīng)用，針刺機制的研究也深入到信號通路方面，雖然大多只是對某一信號因子的研究，但也提示要利用好CLSM的優(yōu)勢,從信號因子或信號通路方面來探究針刺機制，且重視彼此間的相互關(guān)系，在整體中研究與分析各種信號傳遞的相關(guān)性，為針刺治療腦卒中提供理論基礎(chǔ)。

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The Advances of Applications of Confocal Laser Scanning Microscope in Studying the Therapeutic Mechanism of Apoplexy with Acupuncture

XUXiu-hong1,HONGJin-ni2,ZHOUGuo-ping1.

(1.AcupunctureandMassageDepartment,TCM-IntegratedHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2.TheschoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:Confocal laser scanning microscope(CLSM)is a new,non-invasive image analyzer,characterized with real-time high resolution imaging and simple specimen preparation,it is a new research tool in the study of morphology,molecular biology,neuroscience and so on.Acupuncture therapy is effective for the treatment of Apoplexy and more and more attention is focused on the research of its mechanism.CLSM is widely applied in the study of therapeutic mechanism of cerebrovascular disease(CVD) treated with acupuncture.Here is to make a review of the advances of applications of CLSM in studying the therapeutic mechanisms of CVD treated with acupuncture.

Key words:Cerebrovascular disease； Confocal laser scanning microscopy; Acupuncture

收稿日期：2014-05-04修回日期：2014-08-15編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81173355)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.08.037

中圖分類號：R332; R331

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)08-1441-03