杜萍萍,張瑩瑩,申培立,李志輝,于宏偉,盧海強,蘇旭東,張 偉,檀建新

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術中心,河北保定 071001)

?

一株產(chǎn)耐高溫堿性脂肪酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

杜萍萍,張瑩瑩,申培立,李志輝,于宏偉,盧海強,蘇旭東,張 偉,檀建新*

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術中心,河北保定 071001)

用Tween平板法從采集自河北省的122份土樣中篩選到一株脂肪酶活性較高的菌株Lipa1318。綜合其形態(tài)學和生理生化特征以及16S rDNA的序列比對結(jié)果,確定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。其所產(chǎn)胞外脂肪酶的最適反應溫度為60℃,最適pH為8.0,是一種耐熱的堿性脂肪酶。搖瓶發(fā)酵實驗證明該菌株的最適產(chǎn)酶條件為:葡萄糖1.0%,牛肉膏1.0%,TritonX-100 1.5%,橄欖油0.50%,CaCl20.50mmol/L,發(fā)酵液初始pH為8.0,30℃培養(yǎng)96h,通過發(fā)酵條件的優(yōu)化使酶活提高了3.6倍。

脂肪酶,粘質(zhì)沙雷氏菌,發(fā)酵條件

脂肪酶(EC 3.1.1.3),又稱三酰甘油酰基水解酶,是一類水解長鏈脂肪酸甘油酯生成游離脂肪酸和甘油的界面酶[1]。脂肪酶廣泛存在動物、植物和微生物中,微生物脂肪酶種類最多,廣泛存在于細菌、酵母和霉菌中。與動、植物脂肪酶相比,微生物脂肪酶有適宜大規(guī)模生產(chǎn)、易分離提取、具有更廣的pH、溫度適應性等特點,是工業(yè)用脂肪酶的重要來源[2],廣泛應用于食品、制革、飼料、洗滌和油脂化工等工業(yè)領域[3]。

隨著科技發(fā)展和應用的需要,耐極端條件(如低溫、高溫、酸、堿等)脂肪酶的研究已成為該領域的重要方向。耐高溫脂肪酶可用于酶催化制備生物柴油,減少溫度對催化的反應的限制[4]。堿性脂肪酶廣泛應用在洗滌工業(yè)中,可以顯著提高洗衣粉的洗滌效果,尤其是去除黃斑的效果。在食品工業(yè)中添加脂肪酶可縮短乳酪熟成時間,增強乳酪及奶油的風味,生產(chǎn)健康的脂類食品。

目前脂肪酶是作為工業(yè)催化劑用途最廣的酶,但其市場完全被國外少數(shù)公司壟斷,其中丹麥Novo公司占有約80%市場[5]。國內(nèi),脂肪酶的需要主要依賴于進口[6]。因此,脂肪酶具有重要的研究和開發(fā)價值。

本文從122份土樣中篩選到一株酶活較高的菌,通過生理生化鑒定和16S rDNA鑒定,確定為粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)。實驗證明其所產(chǎn)脂肪酶為耐熱堿性脂肪酶。對其產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化,這為擴大脂肪酶的菌種資源及后續(xù)的特征研究和生產(chǎn)應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

從河北省保定市,石家莊市及滄州市肉聯(lián)廠,河北農(nóng)業(yè)大學學校附近等油污豐富的土壤淤泥中采集122份土樣。DNA Ladder Marker,p-MD-19T,Taq DNA聚合酶,PCR試劑,DNA回收試劑盒,質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司,對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP),對硝基苯酚(p-NP)等生化試劑均購自sigma試劑公司；基礎培養(yǎng)基:Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基[7]；篩選培養(yǎng)基:Tween-80瓊脂平板及橄欖油油脂同化平板的配制參見文獻[8-9]。發(fā)酵培養(yǎng)基(%):胰蛋白胨1.0,NaCl 1.0,酵母粉0.50,TritonX-100 0.10,富集液 0.80,調(diào)pH到8.0,121℃滅菌20 min；富集液(%):(NH4)2SO40.10,K2HPO40.10,KCl 0.050,MgSO4·7H2O 0.050,FeSO4·7H2O 0.0010,每5mL富集液加入150μL乳化油。

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YX280B不銹鋼手提壓力滅菌鍋 上海安銳自動化儀表有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備公司；ALC-210.4電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；PB-20 pH計 上海理達儀器廠；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；BINDA 2020D凝膠成像系統(tǒng) 北京賓達英創(chuàng)科技有限公司；SP-756 P紫外可見分光光度計 北京葉之恒科技有限公司；H-1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選 初篩:取1g土樣于5mL富集液中,30℃,200r/min培養(yǎng)48h后,取100μL菌液用無菌水進行梯度稀釋102倍,取100μL涂布于Tween-80培養(yǎng)基平板中,30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48h,選擇周圍產(chǎn)生白色沉淀圈的菌落。以菌落直徑與沉淀圈直徑之比作為初篩依據(jù),將沉淀圈比值較大的菌株保存于LB斜面上以備進一步復篩。

復篩:將初篩到的菌株接種于油脂板上,30℃恒溫箱中培養(yǎng)3d,觀察菌落產(chǎn)生的透明圈的大小。挑取透明圈較大的菌株進行酶活力的測定。

1.2.2 脂肪酶酶活力的測定 采用改良的Winkler和Stuckman p-NPP比色法[10]。以p-NP溶液制備標準曲線[11]。將油脂板復篩中透明圈較大的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,200r/min培養(yǎng)4d。取1mL菌液12000r/min離心1min,收集上清即為粗酶液。

取1mmol/L p-NPP和50mmol/L pH8.0的Tris-HCl溶液各1mL,并在一定溫度下保溫10min,加入100μL粗酶液保溫15min,最后定容至5mL,在425nm下測定溶液OD值,以加熱滅活的酶液做空白對照。在上述實驗條件下以每分鐘水解生成1μmol對硝基苯酚所需酶量定義為一個脂肪酶活力單位(μmol/min)。

1.2.2.1 粗酶液最適溫度及pH的確定 將粗酶液在30～70℃(間隔為5℃)和pH6.0～11.0(間隔1pH單位)的范圍內(nèi)測定脂肪酶的活力以確定最適的酶活反應溫度和pH。

1.2.3 產(chǎn)酶菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學觀察和生理生化實驗 形態(tài)學觀察:將純化的菌株Lipa1318轉(zhuǎn)接入LB固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24h觀察菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。

生理生化實驗:參照《伯杰細菌鑒定手冊》[12]的鑒定方法對菌株Lipa1318進行生理生化鑒定。

1.2.3.2 16S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹 按文獻[13-14]提取菌株Lipa1318基因組作為PCR模板。用16S rDNA通用引物5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′擴增16S rDNA。擴增反應體系為:2μL模板DNA,上下游引物各1μL,2×EsTaq MasterMix 10μL,H2O 6μL。PCR反應條件:94℃,預變性10min；94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s,30個循環(huán),72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取驗證后由華大基因公司測序。將菌株Lipa1318的16S rDNA序列經(jīng)GenBank的BLAST檢索進行系統(tǒng)發(fā)育分析,用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.3.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,以1.0%的胰蛋白胨為氮源,分別以1.0%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、糊精,麥芽糊精,橄欖油,麥芽糖,玉米漿,檸檬酸為碳源,考察其對脂肪酶活力的影響。

1.3.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響 以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,以1.3.1中所測最佳物質(zhì)為碳源,分別以1.0%的酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨,黃豆粉,蠶蛹粉,胰蛋白胨,酵母粉+硫酸銨,蛋白胨+硫酸銨及尿素為氮源,進行最適氮源的篩選。

1.3.3 金屬離子對產(chǎn)酶的影響 以1.3.1中最適碳源和1.3.2中最適氮源代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源及氮源,考察加入不同濃度(0.25、0.50、1.0、1.5mmol/L)的金屬離子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+)對菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。

1.3.4 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響 改變發(fā)酵培養(yǎng)基成分,以所測最適碳氮源代替發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源及氮源,同時添加1.3.3所優(yōu)化的最適金屬離子,考察不同濃度(1.0%、1.5%、2.0%、4.0%)表面活性劑(Tween-80,Tween-20,SDS,TritonX-100)對產(chǎn)酶的影響。

1.3.5 不同誘導物對產(chǎn)酶的影響 按上述優(yōu)化好的碳氮源,金屬離子,表面活性劑對發(fā)酵培養(yǎng)的成分進行調(diào)整,選取葵花籽油,花生油,橄欖油,大豆油,玉米油為誘導物,考察其對菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。每種油脂設四個濃度(0.50%、1.0%、2.0%、4.0%)。

表1 不同菌株的產(chǎn)酶活力Table1 Lipase activity of different isolates

注:數(shù)據(jù)為3次平均值+標準偏差。

表2 菌株Lipa1318生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characters of the strain Lipa1318

注:+表示反應陽性；-表示反應陰性。

1.3.6 初始pH對產(chǎn)酶的影響 在上述最適碳源、氮源、金屬離子、表面活性劑及誘導物下,考察發(fā)酵培養(yǎng)基在不同初始pH下(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)對酶活性的影響,以確定最適的初始pH。

1.3.7 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 在上述優(yōu)化好的發(fā)酵培養(yǎng)基中對菌株進行培養(yǎng),接種量為4.0%,30℃,200r/min培養(yǎng)。從12h之后開始,每隔12h取樣一次,測定菌株的生長曲線及其相應酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

將來自河北省各地的122份土樣用吐溫平板法初篩得到57株產(chǎn)脂肪酶的菌,再通過油脂板復篩得到37株菌。通過p-NPP法測定菌株活性,菌株活性較高的有13株(表1)。將酶活較高的13株菌點接種于吐溫板上,結(jié)果顯示菌株Lipa1318的沉淀圈最大(圖1)。將菌株Lipa1318接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,200r/min培養(yǎng)4d。測定其粗酶液酶活性為2.56U/mL。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株在吐溫板上形成的沉淀圈Fig.1 The opaque zone performed by the lipase producing isolates on Tween-80 agar

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學及生理生化鑒定 菌株Lipa1318在固體LB中30℃培養(yǎng)24h后,菌落淡黃色,中心凸起不透明,邊緣不規(guī)則,表面濕潤。革蘭氏染色陰性,單個菌體在電子顯微鏡下觀察為近球形短桿狀,無芽孢。按文獻[16]進行生理生化鑒定,結(jié)果見表2,綜合菌落和菌體形態(tài)特征、生理生化特征將其歸為粘質(zhì)沙雷氏菌屬。

2.2.2 16S rDNA鑒定 以Lipa1318的基因組為模板進行16S rDNA的PCR擴增,擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠的1600bp處有一條帶,與預測片段大小一致,表明片段擴增正確(圖2)。將PCR產(chǎn)物克隆后測序,并在Genbank中進行Blast比對,結(jié)果表明菌株Lipa1318與S.marcescens的同源性為99%,而與其他細菌的親緣關系較遠,根據(jù)其16S rDNA比對結(jié)果使用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹見圖3。結(jié)合形態(tài)學和生理生化鑒定結(jié)果證明該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)。

圖2 16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 Agarose gel analysis of PCR product of 16S rDNA注：Lane1:Lipa1318; Lane2:1kb DNA Ladder。

2.3 Lipa1318粗酶液的最適溫度和pH

在30～70℃和pH6.0～11.0的范圍內(nèi)測定菌株Lipa1318的粗酶液脂肪酶的活力,由圖4結(jié)果可以看出該酶作用的最適溫度為60℃,最適pH為8.0,酶活為3.56U/mL,表明該酶是一種耐高溫堿性脂肪酶。

圖3 菌株Lipa1318的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Lipa13118

圖4 酶作用的最適溫度及pHFig.4 The optimal temperature and pH of lipase

2.4 菌株Lipa1318產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 碳源和氮源對產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上,對Lipa1318的碳源和氮源進行了篩選。從圖5可以看出,10種碳源對的產(chǎn)酶能力影響差異較大,其中葡萄糖和檸檬酸鈉能促進脂肪酶的產(chǎn)量,因此選取1.0%的葡萄糖為最適碳源。由圖6可知,菌株Lipa1318對有機氮源的利用效率要遠高于無機氮源,且氮源為1.0%的牛肉膏時脂肪酶活力最高,因此確定其為最適氮源。

圖5 不同碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on lipase production

圖6 不同氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on lipase production

2.4.2 金屬離子對產(chǎn)酶的影響 研究表明近三分之一已知酶的活性需金屬離子參與[11]。以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(酶活性為2.56U/mL),由圖7可知,Mn2+對菌株Lipa1318的產(chǎn)酶能力有明顯的抑制作用。0.50mmol/L的Ca2+、Cu2+可增強菌Lipa1318產(chǎn)酶能力,但Zn2+、Fe3+、Mg2+對產(chǎn)酶的影響不大。因此,選取0.50mmol/L的Ca2+為最適金屬離子濃度。

圖7 金屬離子對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different metal ion on lipase production

2.4.3 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響 表面活性劑可以降低培養(yǎng)基的表面張力,改變細胞膜的通透性,從而有利于細胞有毒代謝產(chǎn)物如乳酸等排出胞外,刺激細胞生長[17]。表面活性劑還能改善氧在氣液界面的傳遞速度進而增加產(chǎn)酶量。以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(酶活性為2.56U/mL),如圖8所示的4種表面活性劑中,TritonX-100的效果普遍優(yōu)于其他表面活性劑。1.5%的TritonX-100可使酶活提高7.90U/mL。SDS及Tween-20對菌株的產(chǎn)酶能力有抑制作用。

圖8 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of different surface active agents on lipase production

2.4.4 誘導物對產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)基中添加合適的誘導物可有效刺激微生物的產(chǎn)酶量。本實驗選取葵花籽油,花生油,橄欖油,大豆油,玉米油為誘導物,每種油脂設四個濃度(0.50%,1.0%,2.0%,4.0%)。以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(酶活性為2.56U/mL),如圖9所示,一定濃度的橄欖油和玉米油均對產(chǎn)酶有一定的促進作用。體積分數(shù)為0.5%的橄欖油可有效刺激菌株S.marcescensM1318產(chǎn)脂肪酶,且酶活提高到6.43U/mL。體積分數(shù)為2.0%的玉米油可將酶活提高到6.07U/mL。因此選取0.50%的橄欖油為最適誘導物。

圖9 不同油脂對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of different oils on lipase production

2.4.5 初始pH對產(chǎn)酶的影響 合適的培養(yǎng)基pH可有效增加菌株產(chǎn)酶量。由圖10可知,初始pH為8.0時脂肪酶活力最高,酶活可達到9.16U/mL。在酸性條件下菌株的生長受到一定抑制,因此酶活力較低。

圖10 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of initial pH on lipase production

2.4.6 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 按4.0%接種量接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,200r/min培養(yǎng),圖11為發(fā)酵液中相對生物量%(以發(fā)酵液在12h的OD600為標準即為100%)和脂肪酶活力變化的結(jié)果。0～12h為生長停滯期,12～48h為對數(shù)生長期,48～96h為穩(wěn)定期,96h后為衰退期。結(jié)合產(chǎn)酶曲線來看,發(fā)酵24h后開始產(chǎn)酶,隨著菌體數(shù)量的增加酶活也在逐漸增加。進入穩(wěn)定期后菌體數(shù)量基本不變,此時酶活增加最快。在穩(wěn)定期后期酶活達到最大,為9.16U/mL。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為菌株Lipa1318所產(chǎn)脂肪酶為胞外酶,該酶在細胞內(nèi)合成且釋放到培養(yǎng)基中需要一定時間。進入穩(wěn)定期后菌體數(shù)量達到最大,因此酶活增加速度變大。進入穩(wěn)定期后期,菌體開始裂解,胞內(nèi)的酶系得到釋放,脂肪酶的活力達到最大。但隨著菌體的裂解,胞內(nèi)的蛋白酶可能也釋放到培養(yǎng)基中,這導致進入衰退期后脂肪酶活力的下降。因此,最適的發(fā)酵時間為96h。

圖11 菌株Lipa1318脂肪酶發(fā)酵曲線Fig.11 Fermentation curve of lipase activity from Lipa1318

3 結(jié)論與討論

本文篩選到一株酶活較高的菌株Lipa1318。通過形態(tài)學,生理生化實驗,16S rDNA序列比對分析的方法,確定該菌株為S.marcescens。對該菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化,結(jié)果顯示該菌的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為:碳源為1.0%葡萄糖,氮源為1.0%牛肉膏,以1.5%TritonX-100作為表面活性劑,以0.50%橄欖油為誘導物,0.50mmol/L CaCl2,培養(yǎng)基的初始pH為8.0,30℃條件下培養(yǎng)96h。對S.marcescensM1318 所產(chǎn)的胞外脂肪酶進行研究,結(jié)果顯示,該酶的最適反應溫度為60℃,最適pH為8.0,是典型的中度耐高溫堿性脂肪酶。

粘質(zhì)沙雷氏菌是重要的脂肪酶產(chǎn)生菌,它所產(chǎn)的脂肪酶不僅可以合成冠狀動脈血管擴張劑地爾硫卓的手性前體[18],而且具有在有機溶劑中穩(wěn)定性好、廣泛的底物特異性和異構(gòu)體選擇性等特性[15],還可以用于轉(zhuǎn)酯化反應生產(chǎn)生物柴油。

就產(chǎn)脂肪酶細菌而言,研究最多的為假單胞菌屬(Pseudomonas),而粘質(zhì)沙雷氏菌的研究相對較少。藍卉[5]等篩選到的S.marcescensSYBC Y-R菌株的酶活最高可達1.07U/mL。劉義[19]等報道的菌株S. sp. HS-L5的酶活為1.5U/mL。本實驗篩選到的菌株Lipa1318的酶活可達9.16U/mL,因此,該菌株作為出發(fā)菌株在脂肪酶生產(chǎn)方面具有一定開發(fā)潛力。另外,已報道的產(chǎn)生熱穩(wěn)定性良好脂肪酶的微生物中關于粘質(zhì)沙雷氏菌的報道較少。鄒文欣[20]等報道S.liquefaciensS33的最適反應溫度為44℃,pH為8.0。王利群[15]等篩選到一株脂肪酶菌株S. sp. CF-12在40℃,pH為8.0時酶活最高。李長春[21]等報道的S.marcescensSLP-1的最適酶促反應溫度為50℃。與以往報道的粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶相比,Lipa1318所產(chǎn)脂肪酶的最適酶促反應溫度為60℃,pH為8.0,有別于上述菌株,具有很好的開發(fā)潛力。

[1]Jaeger K E,Eggert T. Lipases for Biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology,2002,13(4):390-397.

[2]汪小鋒,王俊,楊江科,等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的研究進展[J].生物技術通報,2008,47-53.

[3]劉海洲,吳小飛,牛佰慧,等.脂肪酶在食品工業(yè)中的應用與研究進展[J].糧食加工,2008,33(5):55-57.

[4]肖海群.脂肪酶產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件的研究[D]. 南昌:南昌大學,2007.

[5]藍卉,蔡宇杰,廖祥儒,等.一株低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與產(chǎn)酶發(fā)酵初探[J].食品與生物技術學報,2009,28(4):550-554.

[6]李軍紅,姜紹通,童洋洋.產(chǎn)脂肪酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(26):15840-15842.

[7]Sambrook J,Frish E F,Maniatis T. Molecular Cloning:A laboratory Manual(Second Edition)[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,903.

[8]伍康榮,鄧璐璐,楊銳旺,等.脂肪酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2012,100-102.

[9]Choo D W,Kurihara T,Suzuki T,et al. A cold adapted lipase of an Alaskan psychographPseudomonasp. strain B11-1:Gene cloning and enzyme purification and characterization[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(2):486-491.

[10]Winkler U,Stuckmann M. Glycogen,hyaluronate,and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exo-lipase bySerratiamarcescens[J]. Journal of Bacteriology,1979,138:663.

[11]郄曉莎.低溫脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2007.

[12]布坎南 R E,吉本斯 N E. 《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[M].北京科學出版社,1984:452-454.

[13]方珊,劉浩浩,李華林,等.新型脂肪酶基因的克隆與表達[J].食品與藥品,2013,15(1):15-17.

[14]肖冬.低溫脂肪酶產(chǎn)生菌Trichosporonpullulans的脂肪酶基因克隆[J].化學與生物工程,2012,29(6):71-76.

[15]王利群,汪慶,何玉財,等.一株脂肪酶產(chǎn)生菌及其脂肪酶催化性質(zhì)的初步研究[J].化工進展,2012,31(3):642-648.

[16]閆云君,舒正玉,楊江科.細菌脂肪酶的結(jié)構(gòu)和功能研究進展[J].食品與生物技術學報,2006,25(4):121-126.

[17]趙偉,王俐瓊,鄭甲，等.產(chǎn)脂肪酶菌株的分離、鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].湖南師范大學自然科學學報,2010,33(3):88-92.

[18]李志明.《食品衛(wèi)生微生物檢驗學》[M].化學工業(yè)出版社,2009:24-25.

[19]劉義,孟麗君,樓夢,等.1株脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其脂肪酶基因的克隆表達[J]. 華中師范大學學報(自然科學版),2011,45(3):444-449.

[20]鄒文欣,劉慧,郁文煥.脂肪酶產(chǎn)生菌Serratialiquefaciens的分離及其酶性質(zhì)的研究[J].南京大學學報,1996,32(4):713-716.

[21]李長春.堿性脂肪酶高產(chǎn)菌Serratiasp. SL-11的篩選及酶的分離純化與部分性質(zhì)研究[D]. 重慶:西南大學,2006.

Screening of a thermosTablealkaline lipase producing strain and optimization of fermentation condition for Lipase production

DU Ping-ping,ZHANG Ying-ying,SHEN Pei-li,LI Zhi-hui,YU Hong-wei,LU Hai-qiang,SU Xu-dong,ZHANG Wei,TAN Jian-xin*

(Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing College of Food Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

Using the plate assay method with Tween 80 as substrate of lipase,122 soil samples collected from Hebei province were screened and a bacterial strain Lipa1318 with high lipase activity was obtained. The results of morphological features,the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence alignment analysis demonstrated that the isolate wasSerratiamarcescens. The optimal temperature and pH of the extracellular lipase were 60℃ and 8.0,which indicated that the lipase was a thermosTablealkaline lipase. The optimal fermentation condition for high lipase production in flask were as follows:glucose 1.0%,beef extract 1.0%,TritonX-100 1.5%,olive oil 0.50%,CaCl20.50mmol/L,the initial pH(8.0)and temperature(30℃),culture time(96h). Under these conditions,the lipase activity was increased by 3.6 times.

lipase;Serratiamarcescens;fermentation condition

2014-07-24

杜萍萍(1988- )，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物學。

*通訊作者:檀建新(1968-)，男，博士，教授，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

多谷物主食冷凍面團的關鍵技術研究(13227105D);植物多酚類功能性物質(zhì)對A形成的影響(冀人社字[2010]195號)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0188-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.033