張 昊，尹 璇，陳建平，馬 莉，張春江，劉 春

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·論著·

活性維生素D3對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響

張 昊，尹 璇，陳建平，馬 莉，張春江，劉 春

目的 探討活性維生素D3〔1,25(OH)2D3〕對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡的影響，并初步探究其作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)組，1,25(OH)2D3組,EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組系膜細(xì)胞的凋亡率，Western blotting檢測(cè)各組半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，EGF組系膜細(xì)胞凋亡率降低，Caspase-3表達(dá)量降低(P<0.05)，1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞的凋亡率升高，Caspase-3表達(dá)量升高(P<0.05)；與EGF組比較，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞的凋亡率升高，Caspase-3表達(dá)量升高(P<0.05)；EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組與正常對(duì)照組系膜細(xì)胞的凋亡率和Caspase-3表達(dá)量間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 1,25(OH)2D3可能是通過(guò)上調(diào)Caspase-3的表達(dá)而誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的凋亡。EGF可抑制人系膜細(xì)胞的凋亡，1,25(OH)2D3可逆轉(zhuǎn)EGF對(duì)系膜細(xì)胞凋亡的抑制作用。

人系膜細(xì)胞；1,25(OH)2D3；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；表皮生長(zhǎng)因子

張昊，尹璇，陳建平，等.活性維生素D3對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(5)：540-543.[www.chinagp.net]

Zhang H,Yin X,Chen JP,et al.Effect of 1,25(OH)2D3on apoptosis of human mesangial cells and Caspase-3 expression[J].Chinese General Practice，2015，18(5)：540-543.

人系膜細(xì)胞是腎臟主要固有細(xì)胞之一，人系膜細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積是系膜增生性腎小球腎炎的主要病理特征[1]。在腎臟疾病炎癥的修復(fù)過(guò)程中可以通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)消除過(guò)度增殖的系膜細(xì)胞[2]。近期研究表明，活性維生素D3〔1,25(OH)2D3〕除具有調(diào)節(jié)機(jī)體的鈣、磷代謝作用外，還具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[3]。本課題組前期已經(jīng)證實(shí)1,25(OH)2D3能夠抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[4]。本研究擬通過(guò)建立表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖微環(huán)境，觀察1,25(OH)2D3及EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步探究活性維生素D3對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為臨床治療增生性腎小球腎炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人腎小球系膜細(xì)胞株(4200)購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 EGF(美國(guó)Peprotech公司)和1,25(OH)2D3(Sigma公司)、AnnexinV/PI雙染法凋亡試劑盒(美國(guó)Biovision公司)、胰蛋白酶和低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品)、胎牛血清(Hyclong公司)，兔抗人Caspase-3單克隆抗體(Cell Signaling公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體，山羊抗兔IgG二抗，山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司IX71)、普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 系膜細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞干預(yù) 收集對(duì)數(shù)期系膜細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁，棄完全培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液同步化24 h，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：空白對(duì)照組加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基；EGF組加含10 μg/L EGF的培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)；1,25(OH)2D3組加含8～10 mol/L 1,25(OH)2D3的培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)；EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組加10 μg/L EGF及10-8mol/L 1,25(OH)2D3的培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)，均作用48 h后收集細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)系膜細(xì)胞凋亡 選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞,用不含EDTA的胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同步化于G0期，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同藥物處理48 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)收集細(xì)胞；加入500 μl的1×Buffer懸浮細(xì)胞。向各離心管加入5 μl Annexin V溶液混勻后，加入10 μl PI染液混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組系膜細(xì)胞的凋亡，并采圖。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算各組系膜細(xì)胞的凋亡率。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)系膜細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá) 選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞,胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，接種于一次性培養(yǎng)瓶，24 h后細(xì)胞貼壁，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同步化于G0期，按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，13 000×g4 ℃離心25 min，取上清液煮沸10 min使蛋白變性，上樣電泳，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)轉(zhuǎn)膜，5%奶粉封閉，將PVDF膜置于一抗孵育(4 ℃過(guò)夜)，加入含Tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)中洗滌3×10 min，二抗孵育(室溫1 h),TBST洗滌3×10 min，加化學(xué)發(fā)光底物，暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)48h后系膜細(xì)胞凋亡率的比較 干預(yù)48h后，4組系膜細(xì)胞凋亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133.598,P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，EGF組系膜細(xì)胞凋亡率降低，1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組與正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與EGF組比較，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。

Table1Comparisonofapoptosisrateofmesangialcellsafter48hoursinterventionineachgroup

組別細(xì)胞凋亡率正常對(duì)照組31±10 EGF組06±03? 1，25(OH)2D3組64±08? EGF聯(lián)合1，25(OH)2D3組35±10▲△

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與EGF組比較，▲P<0.01；與正常對(duì)照組比較，△P>0.05

2.2 Western blotting檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 正常對(duì)照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Caspase-3/β-actin灰度值比值分別為(0.545±0.028)、(0.386±0.007)、(0.772±0.040)、(0.566±0.031)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=88.380，P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，EGF組系膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量降低(P<0.05)，1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量增高(P<0.05)，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量與正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；EGF組低于EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組系膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量(P<0.05，見圖2)。

注:以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分為4個(gè)區(qū)，1區(qū):機(jī)械損傷細(xì)胞(AnnexinV FITC-/PI+) ；2區(qū):凋亡晚期或壞死細(xì)胞(AnnexinV FITC+/PI+)； 3區(qū):活細(xì)胞(Annexin V FITC-/PI-)；4區(qū):早期凋亡細(xì)胞(Annexin V FITC+/PI-)；計(jì)數(shù)4區(qū)細(xì)胞比例為細(xì)胞凋亡率

圖1 各組干預(yù)48 h后系膜細(xì)胞凋亡率

Figure 1 Apoptosis rate of mesangial cells after 48 hours intervention in each group

注：N組為正常對(duì)照組，E組為EGF組，V組為1,25(OH)2D3組，EV組為EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組

圖2 各組干預(yù)48 h后系膜細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)

Figure 2 Expression of Caspase-3 of mesangial cells after 48 hours intervention in each group

3 討論

3.1 1,25(OH)2D3與系膜細(xì)胞凋亡 1,25(OH)2D3是一類脂溶性維生素，屬于類固醇激素，其經(jīng)典的生理功能是通過(guò)與骨、腸、腎等靶器官細(xì)胞內(nèi)的特異性受體結(jié)合，調(diào)節(jié)機(jī)體的鈣、磷代謝。近期流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)研究表明，1,25(OH)2D3還具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[3-5]。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定條件下的程序性死亡，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞的增殖分化共同維持細(xì)胞群的動(dòng)態(tài)平衡[6]。隨著對(duì)1,25(OH)2D3研究的深入，其對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用越來(lái)越多的受到研究者的關(guān)注[7]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)：1,25(OH)2D3可以抑制體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，此作用在48 h時(shí)最明顯[8]。本研究采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組系膜細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞48 h后系膜細(xì)胞凋亡率增高，提示1,25(OH)2D3可誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞的凋亡，這一結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致[8]。

3.2 1,25(OH)2D3對(duì)系膜細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的影響 Caspases是一種具有特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一組在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。當(dāng)細(xì)胞受凋亡信號(hào)刺激后，凋亡調(diào)控分子間的相互作用,Caspases活化，并通過(guò)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[9]。內(nèi)在和外在的凋亡途徑中均有Caspase-3的表達(dá)增高，Caspase-3導(dǎo)致了一些結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白的裂解，從而引起細(xì)胞凋亡[10]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌(SCC)細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)該細(xì)胞中的Caspase-3的活化，凋亡的發(fā)生與蛋白激酶 B(Akt)磷酸化水平降低有關(guān)[11]。本研究中，1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)量較正常組升高，從蛋白水平提示1,25(OH)2D3可能是通過(guò)上調(diào)Caspase-3的表達(dá)而誘導(dǎo)了系膜的細(xì)胞凋亡。

3.3 EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)系膜細(xì)胞凋亡和Caspase-3表達(dá)的影響 一般來(lái)說(shuō)，增生性腎炎早期多表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞數(shù)量增加，而系膜細(xì)胞數(shù)量又受細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的雙重影響。正常腎臟腎小球細(xì)胞凋亡率是很低的，但在腎小球腎炎中細(xì)胞凋亡明顯增加，過(guò)度增殖的腎小球系膜細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞凋亡而被清除[12]。EGF是一種多肽促生長(zhǎng)因子，其可以刺激上皮細(xì)胞及體內(nèi)多重類型組織細(xì)胞分裂和增殖[13]，并且有研究表明EGF可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖[14]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子前體(ProHB-EGF)轉(zhuǎn)染的大鼠系膜細(xì)胞可抑制過(guò)氧化氫或氫化可的松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并增加了Bcl-2的表達(dá)，降低了Caspase-3的釋放，證明作為EGF家族成員之一的HB-EGF可以抑制系膜細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖微環(huán)境，探討增殖狀態(tài)下1,25(OH)2D3對(duì)系膜細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，EGF組系膜細(xì)胞的凋亡率顯著降低，Caspase-3表達(dá)量顯著降低，證明了EGF可能通過(guò)下調(diào)Caspase-3的表達(dá)而抑制了系膜細(xì)胞的凋亡；與EGF組比較，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組干預(yù)人腎小球系膜細(xì)胞48 h后，人腎小球系膜細(xì)胞的凋亡率顯著增高，Caspase-3表達(dá)量顯著增高，提示1,25(OH)2D3可逆轉(zhuǎn)EGF對(duì)系膜細(xì)胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，1,25(OH)2D3可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的凋亡，并且可能通過(guò)上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)系膜的細(xì)胞凋亡；EGF可能通過(guò)下調(diào)Caspase-3的表達(dá)而抑制系膜細(xì)胞的凋亡。1,25(OH)2D3可逆轉(zhuǎn)EGF對(duì)系膜細(xì)胞凋亡的抑制，但具體作用機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

(1)本文首次探討了1,25(OH)2D3對(duì)人系膜細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的影響 ，并初步證明1,25(OH)2D3可能是通過(guò)上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)了人系膜細(xì)胞的凋亡。

(2)本文建立了EGF誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞增殖微環(huán)境，初步探討增殖狀態(tài)下1,25(OH)2D3對(duì)人系膜細(xì)胞的影響,得出結(jié)論：EGF可能通過(guò)下調(diào)Caspase-3的表達(dá)而抑制了人系膜細(xì)胞的凋亡，1,25(OH)2D3可逆轉(zhuǎn)EGF對(duì)人系膜細(xì)胞凋亡的抑制。參考文獻(xiàn)

[1]Guan T,Gao Q,Chen P,et al.Effects of polycystin 1 N terminal fragment fusion protein on the proliferation and apoptosis of rat mesangial cells[J].Molecular Medicine Reports,2014,10(3):1626-1634.

[2]Li R,Lou Y,Zhang W,et al.Vitamin D inhibition of lung adenocarcinoma cell proliferation in vitro[J].Tumour Biology,2014,35(11):10953-10958.

[3]Cove-Smith A,Hendry BM.The regulation of mesangial cell proliferation[J].Nephron Experimental Nephrology,2008,108(4):e74-79.

[4]Yang XP,Zhang JP,Zhang CJ,et al.Effects of active vitamin D3in the expression of cell proliferation and apoptosis in mesangial proliferative glomerulonephritis in rats[J].China Pharmacist，2010，13(11):1551-1554.(in Chinese) 楊曉萍,張金平,張春江,等.活性維生素 D3對(duì)大鼠系膜增生性腎炎細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)藥師,2010，13(11):1551-1554.

[5]Huang Y,Luo F,Li H,et al.Conditioned medium from alternatively activated macrophages induce mesangial cell apoptosis via the effect of fas[J].Experimental Cell Research,2013,319(19):3051-3057.

[6]Hughes J,Savill JS.Apoptosis in glomerulonephritis[J].Current Opinion in Nephrology and Hypertension,2005,14(4):389-395.

[7]Ma Y,Yu WD,Hidalgo AA,et al.Inecalcitol,an analog of 1,25(OH)2D3,displays enhanced antitumor activity through the induction of apoptosis in a squamous cell carcinoma model system[J].Cell Cycle,2013,12(5):743.

[8]Zhao D，Luo X，Zhang CJ，et al.Effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3on the growth of rat glomerular mesangial cells[J].Journal of Clinical and Experimental Medicine,2011,10(7):486-488.(in Chinese) 趙丹,羅星,張春江,等.1,25(OH)2D3對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(7):486-488.

[9]MacKenzie SH,Clark AC.Death by caspase dimerization[M]//Protein dimerization and oligomerization in biology.New York:Springer,2012:55-73.

[10]Feinstein-Rotkopf Y,Arama E.Can′t live without them,can live with them:roles of caspases during vital cellular processes[J].Apoptosis,2009,14(8):980-995.

[11]Ma Y,Yu WD,Kong RX,et al.Role of nongenomic activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways in 1,25(OH)2D3-mediated apoptosis in squamous cell carcinoma cells[J].Cancer Research,2006,66(16):8131-8138.

[12]Watson S,Cailhier JF,Hughes JF,et al.Apoptosis and glomerulonephritis[J].Apoptosis and Glomerulonephritis，2006，9:188-204.

[13]Master AM,Sen Gupta A.EGF receptor-targeted nanocarriers for enhanced cancer treatment[J].Nanomedicine,2012,7(12):1895-1906.

[14]Kumar D,Bhaskaran M,Alagappan L,et al.Heme oxygenase-1 modulates mesangial cell proliferation by p21waf1 upregulation[J].Renal Failure,2010,32(2):254-258.

[15]Yagi K,Takemura T,Hino S,et al.Promotion of survival and prevention of apoptosis in rat mesangial cells by a membrane-anchored form of heparin-binding EGF-like growth factor[J].Clinical and Experimental Nephrology,2001,5(3):177-185.

(本文編輯：趙躍翠)

Effect of 1,25(OH)2D3on Apoptosis of Human Mesangial Cells and Caspase-3 Expression

ZHANGHao,YINXuan,CHENJian-ping,etal.

MedicalCollegeofShiheziUniversityofXinjiang,Shihezi832000,China

Objective To investigate the effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3〔1,25(OH)2D3〕 on apoptosis of human mesangial cells and its mechanism.Methods The mesangial cells cultured in vitro were divided randomly into groups A (normal control group),B〔epidermal growth factor(EGF)group〕,C〔1,25(OH)2D3group〕,D〔combined group of EGF and 1,25(OH)2D3〕.Flow cytometry was used to determine the apoptosis rates,the Western blotting to detect the expression of cysteine proteinase-3 (caspase-3) in 4 groups.Results As compared with group A,the apoptosis rate of mesangial cells decreased,caspase-3 expression reduced in group B(P<0.05),the apoptosis rate of mesangial cells and caspase-3 expression increased in group C(P<0.05).As compared with group B,the apoptosis rate of mesangial cells and caspase-3 expression elevated in group D(P<0.05),there was no significant difference between groups A,D(P>0.05).Conclusion 1,25(OH)2D3may induce the apoptosis of mesangial cells through up-regulating casoase-3 expression.EGF inhibits the apoptosis,1,25(OH)2D3can reverse the inhibition of EGF on mesangial cells.

Human mesangial cells；1,25(OH)2D3；Apoptosis；Caspase-3；Epidermal growth factor

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160090)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)(張昊，尹璇，陳建平，馬莉)；石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科(張春江，劉春)

劉春，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科；E-mail：liuchun1966@163.com

R 346.53

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.05.013

2014-09-25；

2014-11-25)