馬流產(chǎn)沙門菌fimY 基因同源性分析及蛋白表達(dá)

王世民，王彩蝶，張艷楠，蘇　艷（.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005；.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005）

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馬流產(chǎn)沙門菌fimY 基因同源性分析及蛋白表達(dá)

王世民1，王彩蝶1，張艷楠2，蘇艷1
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

摘 要：為對馬群中沙門菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測，根據(jù)GenBank公布的沙門菌菌毛蛋白fimY基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)一對特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增fimY部分基因。將fimY目的基因亞克隆至PGEX-4T-2原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對目的蛋白進(jìn)行反應(yīng)性檢測。結(jié)果表明，克隆fimY基因大小為490bp；成功構(gòu)建fimY原核表達(dá)載體PGEX-fimY，經(jīng)SDS-PAGE顯示帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白大小為47ku，與預(yù)期相符；Western blot證明，目的蛋白fimY能夠結(jié)合沙門菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，為建立馬流產(chǎn)沙門菌間接ELISA檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬流產(chǎn)沙門菌；fimY；抗原性；同源性

沙門菌血清型繁多，耐藥性較為普遍，能夠感染人和多種動物，對人類健康及畜牧業(yè)養(yǎng)殖造成很大危害［1-2］。但馬流產(chǎn)沙門菌（Salmonella abortus equi）只感染馬屬動物，具有高度專嗜性，對其他動物無致病性［3］。馬流產(chǎn)沙門菌主要危害孕馬和幼駒，引起孕馬流產(chǎn)、幼駒心肌炎等癥狀，馬群感染后會迅速傳播、流產(chǎn)率可達(dá)100%，對養(yǎng)馬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展。目前對細(xì)菌性馬流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)依舊為傳統(tǒng)血清凝集試驗(yàn)，該試驗(yàn)敏感性和準(zhǔn)確性不高，試驗(yàn)周期長，結(jié)果判斷有很大的主觀性，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展，需研究一種新方法來適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展［4-7］。

到目前為止，還不能夠在公開數(shù)據(jù)庫檢索到馬流產(chǎn)沙門菌基因組序列等相關(guān)信息，這無疑給該菌檢測方法的研究增添了困難。與馬流產(chǎn)沙門菌相比較，食源性沙門菌和其他畜禽沙門菌檢測方法研究的都較為深入。伍燕華等建立了雙抗體夾心ELISA檢測沙門菌方法［8］，張艷紅等總結(jié)食源性沙門菌診斷方法中提到沙門菌ELISA檢測方法已逐步走向應(yīng)用的趨勢等［9］，曹恬雪等對沙門菌相關(guān)毒力因子做了總結(jié)［10］，其中，fimY基因?yàn)樯抽T菌菌毛亞單位的調(diào)控基因，對菌毛發(fā)育起到很重要的調(diào)節(jié)作用［11-12］。本試驗(yàn)通過已發(fā)表的鼠傷寒沙門菌fimY基因模板設(shè)計(jì)特異性引物“獵取”馬流產(chǎn)沙門菌fimY部分基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體并對誘導(dǎo)蛋白進(jìn)行抗原性分析，為建立馬流產(chǎn)沙門菌間接ELISA檢測方法奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及培養(yǎng)基 馬流產(chǎn)沙門菌（CVCC514）購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；牛心湯培養(yǎng)基、氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）、緩沖蛋白胨水（BPW）、SS瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司。1.1.2 主要試劑及儀器 LA Taq DNA酶、BamHⅠ內(nèi)切酶、XhoⅠ內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（低）均購自寶生物工程大連有限公司；PM Western Midview、DNA產(chǎn)物回收試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞菌購自天根生化科技（北京）有限公司；沙門菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗馬二抗購自美國Proteintech公司；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。PCR儀為美國Bio-Rad Mycycler；電轉(zhuǎn)儀為Bio-Rad Trams blot小型轉(zhuǎn)印槽。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank發(fā)表的鼠傷寒沙門菌fimY序列（GI：332986951），用Oligo 6.0設(shè)計(jì)特異性引物，并用生物軟件DNA Man對引物進(jìn)行評價(jià)，引物序列下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，fimY F：5′-AT GGATCCAGTCACTACTTATTTTCCGG-3′，fimY R：5′-TTCTCGAGAGAGGGTGATA-AGTTGTTTAAGCCG-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2DNA模板的制備 用生理鹽水重懸離心收集對數(shù)期細(xì)菌，反復(fù)3次，沸水浴10min，1 200r/min離心2min，收集上清，以該處理樣品做為PCR模板。

1.2.3PCR擴(kuò)增目的基因 PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×LA PCR buffer 2.5μL，2.5mmol dNTP 2.5 μL，上、下游引物各10nmol，菌液模板0.5μL，LA Taq酶0.2μL，滅菌去離子水17.3μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒進(jìn)行純化回收，純化產(chǎn)物置-20℃保存待用。另送PCR樣品由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.2.4fimY部分基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 將PGEX-4T-2空載質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物純化后分別進(jìn)行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，37℃3h；酶切后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，并對目的條帶進(jìn)行膠回收。將PGEX4T-2空載及PCR回收產(chǎn)物按照摩爾數(shù)1∶3比例進(jìn)行連接，16℃，過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h。對陽性克隆菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR方法鑒定陽性質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序正確后命名PGEX-fimY質(zhì)粒。

1.2.5目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將PGEX-fimY轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，篩選陽性克隆，方法同上。將PGEX-fimY陽性克隆接種于氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液按10 mL/L比例接種于新鮮氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液OD600nm值達(dá)到0.6左右時(shí)，加入終濃度0.4mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收集菌，同時(shí)設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌做對照組。

1.2.6SDS-PAGE電泳 對誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)菌測量OD600nm值，兩種菌各吸取1mL，1 200r/min離心2min，收集細(xì)菌。加入體積為（50×OD600nm）μL的PBS重懸，加入相應(yīng)體積5×SDS loading buffer混勻，沸水浴15min后，8 000r/min離心2 min。取10μL各樣品于150g/L聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80V電壓電泳30min后，120V電壓電泳2h。配方見分子生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)。

1.2.7Western blot檢測 配制150g/L聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，每孔加入20μL處理樣品（方法同上），10μL PM Western Midview標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，電泳后將帶有樣品蛋白的凝膠電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜）上，恒流0.3A，轉(zhuǎn)移時(shí)間1h。將NC膜置于50g/L脫脂奶粉中4℃封閉過夜；將完成封閉的NC膜放入PBS稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（1∶1 000稀釋）中37℃孵育1h；用PBS對NC膜清洗5次，每次5min；用PBS稀釋的酶標(biāo)二抗（1∶2 000稀釋）對NC膜進(jìn)行第2次孵育，37℃，1h；用PBS 對NC膜清洗5次，每次5min；DAB顯色液進(jìn)行顯色。

2　結(jié)果

2.1目的基因擴(kuò)增結(jié)果

以稀釋馬流產(chǎn)沙門菌菌液作為PCR模板，其產(chǎn)物經(jīng)15g/L的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出490bp左右的目的基因片段（圖1）與預(yù)期大小相符。

圖1　fimY基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of fimY gene

2.2馬流產(chǎn)沙門菌fimY基因測序結(jié)果PCR產(chǎn)物測序結(jié)果見圖2。

圖2　PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of PCR product

2.3馬流產(chǎn)沙門菌fimY基因序列分析結(jié)果

馬流產(chǎn)沙門菌fimY序列Blast結(jié)果共得到39株沙門菌和一株枸櫞酸桿菌，選擇差異性較大的17株不同血清型菌株的fimY序列及枸櫞酸桿菌基因進(jìn)行同源性分析，分別為UK-1株（GI：332986951）、08-1736株（GI：523821078）、CFSAN000189株（GI：523811606）、CFSAN002069株（GI：523802116）、CT＿02021853株（GI：197936256）、SL483株（GI：197211055）、CVM19633株（GI：194709404）、SL254株（GI：194400866）、SPB7株（GI：161361677）、ATCC 9150株（GI：56126533）、CFSAN002050株（GI：523815970）、CFSAN001992株（GI：151908558）、P125109株（GI：206707319）、CT18株（GI：30407157）2007-60-3289-1株（GI：320084732）、SC-B67（GI：62126203）、S06004株（GI：529190224），分析結(jié)果顯示，馬流產(chǎn)沙門菌fimY序列與17株其他沙門菌血清型fimY序列同源性為98.0%～99.8%；與枸櫞酸桿菌ATCC BAA-895株（GI：157081501）同源性為64.4%（圖3）。

圖3　馬流產(chǎn)沙門菌fimY序列同源性分析結(jié)果Fig.3 Sequence homology analysis result of abortus equine SalmonellafimY

2.4PGEX-fimY質(zhì)粒蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

對誘導(dǎo)菌及對照菌處理后，用150g/L SDSPAGE分離膠進(jìn)行電泳，與陰性對照相比，在47ku附近出現(xiàn)明顯條帶（圖4）。

圖4　誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of induced products

2.5Western blot檢測結(jié)果

在Western blot結(jié)果中，在目的蛋白預(yù)期大小位置出現(xiàn)條帶（圖5）。證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)馬流產(chǎn)沙門菌陽性血清能夠與fimY蛋白結(jié)合。

圖5　fimY蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of fimY protein

3　討論

馬流產(chǎn)對養(yǎng)馬產(chǎn)業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，其中細(xì)菌性馬流產(chǎn)危害較為嚴(yán)重。細(xì)菌性馬流產(chǎn)主要由馬流產(chǎn)沙門菌和鼠傷寒沙門菌引起。其中，馬流產(chǎn)沙門菌為專嗜性沙門菌，只感染馬屬動物，對其他宿主動物無致病性；而鼠傷寒沙門菌宿主范圍較廣，致病性較強(qiáng)，是重要的人畜致病菌。能夠造成馬屬動物流產(chǎn)的該兩種菌血清型不同，傳統(tǒng)凝集試驗(yàn)的檢測結(jié)果很容易造成假陰性，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的片面性。因此，亟需研究一種更準(zhǔn)確、快速的診斷方法以適應(yīng)目前我國養(yǎng)馬業(yè)的持續(xù)發(fā)展所帶來的挑戰(zhàn)。

致病性沙門菌吸附和侵入宿主腸上皮細(xì)胞的過程中，菌毛起到重要作用［13-14］。fimY基因是沙門菌I型菌毛調(diào)控調(diào)控基因，具有很好的保守性［15］。本試驗(yàn)克隆的馬流產(chǎn)沙門菌fimY基因通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)與已公布的其他血清型沙門菌同源性高于98%，從而證實(shí)了馬流產(chǎn)沙門菌fimY基因也具有很好的保守性；與其他非沙門菌同源性低于64.4%（同源性最高的非沙門菌是枸櫞酸桿菌），說明馬流產(chǎn)沙門菌fimY基因具有較強(qiáng)種屬特異性；通過Westetn blot試驗(yàn)表明該蛋白能夠結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)馬流產(chǎn)沙門菌陽性血清，說明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本試驗(yàn)為馬流產(chǎn)沙門菌ELISA方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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Homology Analysis and Expression of Gene fimY of Salmonella abortus equine

WANG Shi-min1，WANG Cai-die1，ZHANG Yan-nan2，SU Yan1
（1.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang，830052，China）

Abstract：To survey Salmonellainfection in horse herd quickly and accurately，apair of specific primers were designed according to published fimY sequence of Salmonellain GenBank，and the gene coding partial fimY was amplified by PCR.The gene was subcloned into the prokaryotic expression vector PGEX-4T-2to construct the plasmid and then transfected it into BL21（DE3）competent cells.The positive clone was induced by IPTG to express objective protein.The reactogenicity of objective protein was also detected by Western blot.The results showed that fimY gene coding 490bp was cloned；the prokaryotic expression vector PGEX-fimY was constructed successfully，the molecular weight of GST-tagged objective protein detected by SDS-PAGE was 47ku，and agreed with expectation；the protein can react with standard Salmonella positive serum，which was clarified by Western blot.The study laid the foundation for establishment of an indirect ELISA for detecting Salmonellainfection in equines.

Key words：Salmonella abortus equi；fimY；antigenicity；homology

作者簡介：王世民（1986-），男，河北衡水人，碩士，講師，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)前期資助項(xiàng)目（XJAU201214）

收稿日期：2014-12-04

中圖分類號：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0039-04