劉宏波，宋振全，梁國(guó)標(biāo)，王志軍，趙明光，趙 旭，雷 偉，李 賓

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是交通、工礦事故及運(yùn)動(dòng)意外中的常見損傷，是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。資料顯示，世界上脊髓損傷患者超300 萬［1］，SCI后神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)的發(fā)生率很高(40% ～50%)［2］。其中，中樞性疼痛(central pain，CP)為SCI的頑固性并發(fā)癥［3］，近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，臨床治療效果并不令人滿意。目前認(rèn)為既有外周神經(jīng)敏化又有中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化，除受損神經(jīng)敏化，未受損神經(jīng)以及膠質(zhì)細(xì)胞也參與發(fā)病過程［4］，尤以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用在SCI后的CP中扮演重要角色，其作用主要通過分泌多種細(xì)胞因子得以實(shí)現(xiàn)［5－6］。另外，神經(jīng)病理性疼痛一般均伴有血管功能異常及炎癥現(xiàn)象［7］，而就脊髓損傷而言，血管結(jié)構(gòu)和神經(jīng)成分的破壞導(dǎo)致復(fù)雜劇烈的炎癥反應(yīng)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞連同外周血白細(xì)胞在其中起到重要的作用［8－9］。脊髓損傷后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞將炎癥反應(yīng)與CP的發(fā)生聯(lián)系在一起。血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)是血腦屏障的一部分，功能在于維持脊髓內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;脊髓損傷后，不僅破壞脊髓的實(shí)質(zhì)，同時(shí)破壞了血管的結(jié)構(gòu)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，BSCB也不可避免地遭到破壞，對(duì)受損脊髓炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展有著重要的作用［10］。

羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)是一種血容量擴(kuò)張劑，有維持血液膠體滲透壓的作用，從上世紀(jì)60年代起，作為容量替代和血液稀釋的血漿代用品開始在臨床上大量使用［11－12］。除了其膠體擴(kuò)容作用，中等分子量HES(100～1000 kD)還可以改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，防止和堵塞毛細(xì)血管漏，減輕BSCB開放;全分子量HES(10～3400 kD)無該作用，低分子量HES的作用尚無相關(guān)報(bào)道［13－17］。

本實(shí)驗(yàn)研究大鼠SCI模型建立后通過給予HES(中分子量和小分子量)，探討其對(duì)中樞性疼痛的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD雄性成年大鼠48只，由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200～230g。隨機(jī)分入脊髓壓迫損傷組(A組)，脊髓損傷聯(lián)合低分子量HES治療組(B組)，脊髓損傷聯(lián)合中分子量HES治療組(C組)，以及假手術(shù)組(D組)，每組12只。假手術(shù)組僅行椎板去除術(shù)，A組、B組和C組在脊髓損傷模型建立后經(jīng)尾靜脈按15ml/kg給予生理鹽水、低分子量HES(HES 40，706代血漿，平均分子量40)、中分子量HES(HES 130/0.4，萬汶，德國(guó)費(fèi)森尤斯卡比股份有限公司，平均分子量130kD，取代級(jí)0.4)，5% ×動(dòng)物血容量/次，2次/d。各組在模型建立后3d測(cè)BSCB破壞情況(n=5)，10d進(jìn)行行為學(xué)觀察、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)符合錦州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求。

2 脊髓壓迫傷模型［18］

所有器械經(jīng)高壓蒸汽滅菌。大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后，取俯臥位，于顯微鏡下，將大鼠T7、T8雙側(cè)椎弓根切斷，隨后取下椎板，緊接著植入一種吸水膨脹材料(醫(yī)用PU泡棉)，隨著壓迫物的膨脹逐漸形成不同程度的慢性壓迫脊髓損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。術(shù)后逐層縫合肌肉和皮膚后回籠飼養(yǎng)，定時(shí)定量給以軟飼料喂養(yǎng)，飲水不加限制。術(shù)后開始每日腹腔注射青霉素8萬U/只，慶大霉素0.2萬U/只，預(yù)防術(shù)后感染，維持7d。術(shù)后大鼠每日行膀胱按摩人工排尿2次，直到動(dòng)物恢復(fù)排尿反射。

3 疼痛行為學(xué)測(cè)定

機(jī)械性痛覺過敏:以不同粗細(xì)和不同長(zhǎng)度的尼龍絲制成14個(gè)刺激強(qiáng)度不同(1.0～60g)的機(jī)械刺激器(von-Frey纖維)。將一20cm×20cm×25cm的透明有機(jī)玻璃罩放置于金屬絲制成的網(wǎng)格墊上，將待測(cè)大鼠置于罩中。使其適應(yīng)30min后試驗(yàn)者手持von-Frey纖維穿過金屬絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位，刺激強(qiáng)度由小到大，每個(gè)強(qiáng)度反復(fù)刺激5次(每次間隔3～5s)，將出現(xiàn)50%以上縮足反射的強(qiáng)度定為大鼠對(duì)機(jī)械性痛敏壓力閾值(paw withdrawal pressure threshold，PWPT)。如以60g von-Frey纖維刺激大鼠足底仍不出現(xiàn)縮足反射，則認(rèn)為大鼠無痛反應(yīng);機(jī)械刺激閾值＜0.1g均以0.1g計(jì):這種刺激的原理是當(dāng)尼龍纖維受阻彎曲后其尖端壓力不變，故可以認(rèn)為每個(gè)測(cè)量值都是恒定的。

熱痛覺過敏:將大鼠置于20cm×20cm×25cm的透明有機(jī)玻璃罩中，底部為距試驗(yàn)臺(tái)30cm的2mm厚的玻璃板。應(yīng)用RTY 3型熱刺激儀(西安鳳嵐儀器廠)。選擇100W鹵素投射燈，調(diào)節(jié)電壓至10V，調(diào)節(jié)燈源與玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑為5mm，記錄從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間(s)，作為熱痛敏反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal latency，PWL);重復(fù)測(cè)量3～5次，同一部位間隔10min，不同部位間隔5min，取平均值為熱痛敏反應(yīng)潛伏期并作為定量指標(biāo)。如＞40s無反應(yīng)則停止照射，以免導(dǎo)致足底組織過度熱損傷。

4 脊髓組織伊文氏藍(lán)(EB)含量的測(cè)定

傷后3d的大鼠，經(jīng)大鼠固定器后經(jīng)尾靜脈注射2%EB(2ml/kg體重)，20min后迅速斷頭取脊髓(以損傷節(jié)段為中心約2.5cm長(zhǎng))，剝除硬脊膜并洗去血凝塊，稱重并置于等體積甲酰胺中，置37℃水浴48h，在波長(zhǎng)632nm處測(cè)光密度值(OD)。

5 組織學(xué)觀察

動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)間以10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后，灌注固定后取出損傷區(qū)吻端2.5cm到馬尾的脊髓并置于含25%蔗糖的4%多聚甲醛溶液中，至標(biāo)本沉底。每例脊髓取兩段:Ⅰ，第一段損傷區(qū)為中心的1.6cm節(jié)段，Ⅱ，第二段L3～S4節(jié)段，冰凍切片機(jī)(德國(guó)，Leica公司)以10μm厚連續(xù)切片。

切片行免疫熒光雙重標(biāo)記:一抗:兔源抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多抗(1:500，Sigma)，兔源抗小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)單抗(1∶400，Sigma)，小鼠源抗單核巨噬細(xì)胞抗原1(ED1)單抗(1:400，Sigma)。二抗:偶聯(lián)異硫氰酸熒光素(FITC)山羊源抗兔二抗(1:500，Sigma)，偶聯(lián)德克薩斯紅(TRITC)的兔源抗小鼠二抗(1:400，Sigma)。著色完畢封片后，在激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000系統(tǒng)，奧林巴斯公司)上觀察并采圖。

6 脊髓組織蛋白提取和定量

各組大鼠分別在相應(yīng)時(shí)間隨機(jī)取4只，腹腔麻醉、斷頭取以損傷區(qū)為中心的1.6cm節(jié)段和L3～S4節(jié)段，裝入5ml滅菌離心管并立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩＝M織塊稱量、切碎，置于含0.5%Triton X-100的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.0，20mmol/L)內(nèi)，4℃浸泡24h，組織濃度標(biāo)準(zhǔn)化至400mg/ml。浸泡后，12 000r/min(4℃)離心 20min，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度后，調(diào)至相同濃度，收集上清液并分裝，－80℃冰箱保存。

Western blotting檢測(cè)分析星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)、活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(ED1):每孔樣本上樣量為350μg/L，所用分離膠的濃度為120ml/L。將樣本加入凝膠樣本孔中，以70V的條件進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳;結(jié)束后，以110V的條件轉(zhuǎn)膜3h;用100g/L脫脂奶粉封閉1h后與抗AIP抗體(1:400稀釋)4℃反應(yīng)過夜;經(jīng)洗滌后再與二抗反應(yīng)3h，最后用western blot蛋白質(zhì)印跡法(ECL)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)膜上的抗原抗體復(fù)合物。

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-α，試劑盒購自美國(guó)Abcam公司。具體操作步驟按試劑盒說明書的操作方法進(jìn)行。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，本課題研究結(jié)果均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HES對(duì)血脊髓屏障的影響

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，脊髓壓迫損傷后BSCB便遭到破壞，傷后3d即達(dá)最大值，7d基本恢復(fù)正常。本實(shí)驗(yàn)選擇在傷后3d對(duì)各組間BSCB破壞程度進(jìn)行比較:A組脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)EB含量明顯高于假手術(shù)組(D組)，B組與A組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，C組EB含量顯著低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2 HES 對(duì)慢性中樞性疼痛的作用

脊髓壓迫損傷后可造成后肢癱瘓，傷后8～12d達(dá)到足底著地程度，運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，此時(shí)才能得到穩(wěn)定的疼痛閾值。本實(shí)驗(yàn)對(duì)術(shù)前1d和術(shù)后10、14、20、30、60d 各組大鼠的 PWPT 和 PWL 進(jìn)行測(cè)量。術(shù)前各組間PWPT和PWL無顯著性差異。A組術(shù)后10d始，PWPT和PWL均顯著降低，且隨后各時(shí)間點(diǎn)較10d無明顯差異;B組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)較A組未見明顯差異;C組術(shù)后所測(cè)時(shí)間點(diǎn)的PWPT和PWL均較A組和B組明顯升高(圖2)。

圖1 傷后3d，脊髓組織內(nèi)EB含量

圖2 機(jī)械痛敏和熱痛敏比較

3 HES對(duì)炎癥反應(yīng)的影響

據(jù)報(bào)道，脊髓壓迫損傷后，活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞反應(yīng)在傷后7d達(dá)到高峰，本實(shí)驗(yàn)選擇在傷后7d比較各組炎癥反應(yīng)程度。

對(duì)損傷段脊髓組織GFAP表達(dá)量進(jìn)行觀察，組間均未見差異;Iba1和ED1分別為巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白和溶酶體膜蛋白標(biāo)記物，可反映巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。傷后10d，損傷段:D組各時(shí)間點(diǎn)均可表達(dá)一定量Iba1和少量ED1，A組兩者的表達(dá)較D組有明顯上調(diào)，B組較A組無明顯變化，同時(shí)刻C組較A組和B組均明顯下降(圖3、4)。

對(duì)傷后7d脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)IL-1、IL-6、TNF-α進(jìn)行觀察:損傷段A組與B組間未見明顯差異，D組高于A組和B組，而C組較A組和B組均明顯下降(圖5)。

圖3 損傷段脊髓傷后7d，活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞觀察

圖4 損傷段脊髓傷后7d，星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(Iba1，ED1)特異性標(biāo)記物表達(dá)

圖5 損傷段脊髓傷后7d，IL-1、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)

討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)軸突難以再生，導(dǎo)致神經(jīng)功能無法正?；謴?fù)，患者在損傷平面以下存在感覺、運(yùn)動(dòng)、反射及尿便功能障礙［19－20］。而中樞性疼痛為脊髓損傷的頑固性并發(fā)癥。其致病機(jī)制尚不明確，至今仍無有效的治療手段。目前有文獻(xiàn)報(bào)道膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及一些細(xì)胞因子和趨化因子(IL-1等)與脊髓損傷后中樞性疼痛密切相關(guān)［21］。在脊髓損傷后，組織發(fā)生水腫、缺血低氧，并且血漿內(nèi)的各種分子無選擇性地進(jìn)入脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)部，進(jìn)而誘發(fā)一系列繼發(fā)性損傷并加重脊髓的損傷。BSCB的破壞范圍也隨之?dāng)U大，其結(jié)構(gòu)功能的異常導(dǎo)致血液成分、外周炎性成分大量進(jìn)入脊髓實(shí)質(zhì)，脊髓內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞被激活［21－25］，從而外周單核巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞參與到脊髓損害后炎癥反應(yīng)［26－27］。

中分子量的HES可通過多種機(jī)制抑制毛細(xì)血管漏，挽救異常通透的BSCB，而其他分子量HES無此作用［28－29］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCI動(dòng)物脊髓損傷區(qū)BSCB通透異常增高，傷后2～3d達(dá)到最大值，給予HES 130/0.4可以使之顯著緩解，HES 40組(對(duì)照組)未見相應(yīng)效果。而SCI后行為學(xué)觀察后肢PWPT和PWL明顯降低，HES 130/0.4組痛閾顯著回升，HES 40組則對(duì)痛閾沒有影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明HES 130/0.4可以緩解SCI后CP的程度，而其機(jī)制很可能為挽救異常通透的BSCB。HES 130/0.4在脊髓損傷區(qū)節(jié)段可降低巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度，并使損傷區(qū)的趨化因子表達(dá)下調(diào)?？梢哉f明IL-1、IL-6、TNF-α 表達(dá)下調(diào)可能為 HES 130/0.4 緩解CP的機(jī)制之一;而這些細(xì)胞因子在受損脊髓主要由活化的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌，所以給予HES 130/0.4后巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平的下調(diào)可以進(jìn)一步支持上述推測(cè)。HES 40組未見HES 130/0.4的上述作用，可以說明低分子量HES對(duì)脊髓損傷后BSCB破壞沒有緩解作用，亦間接地說明擴(kuò)容作用不是HES 130/0.4改善脊髓損傷后并發(fā)炎癥和CP的機(jī)制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HES 130/0.4對(duì)脊髓損傷后并發(fā)的中樞性疼痛有緩解作用，其機(jī)制可能為通過改善異常通透的BSCB來抑制其損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)。目前，通過干預(yù)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)來影響中樞性疼痛的研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道;通過調(diào)節(jié)BSCB功能來干預(yù)脊髓損傷中樞性神經(jīng)病理性疼痛的研究尚處于初級(jí)階段，相應(yīng)的機(jī)制研究亦較少，很多還停留在脊髓損傷后BCSB與繼發(fā)性損傷的相關(guān)研究中。通過少量研究報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在脊髓損傷后并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。對(duì)該機(jī)制的研究，可能優(yōu)化我們現(xiàn)有治療的方法，為脊髓損傷后的診治提供一個(gè)新的思路。

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