比較人AB型血清與胎牛血清在結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的作用

金　亮，張　茜，沙　泉

(安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室及過(guò)敏與免疫研究中心，安徽 合肥　230032)

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比較人AB型血清與胎牛血清在結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的作用

金亮，張茜，沙泉

(安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室及過(guò)敏與免疫研究中心，安徽 合肥230032)

摘要:目的觀察添加人AB型血清或胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在結(jié)核桿菌 (M.tb) 全菌裂解物 (WCL)的刺激下增殖差異。方法健康成人PBMC 1×109·L-1，分別加入WCL 20 mg·L-1，或者同時(shí)給予人重組白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)50 U·mL-1，植物血凝素(PHA)5 mg·L-1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。分別在含10%人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)液和10%FBS 的RPMIl640培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)結(jié)果，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果添加人AB型血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，M.tbWCL對(duì)淋巴細(xì)胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養(yǎng)的增殖效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在WCL和rhIL-2混合組中同樣是添加人AB型血清培養(yǎng)增殖效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論當(dāng)以M.tbWCL為抗原的刺激人PBMC時(shí)，淋巴細(xì)胞在添加人AB型血清培養(yǎng)液中比在添加FBS的培養(yǎng)液中增殖效果更加明顯。

關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌;人AB型血清;胎牛血清;外周血單個(gè)核細(xì)胞

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的傳染病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2013年報(bào)告，全世界估算每年新增860萬(wàn)結(jié)核患者，有約130萬(wàn)人死于結(jié)核病(包括32萬(wàn)艾滋病陽(yáng)性者)，中國(guó)占新增病例數(shù)的12%，僅次于印度(26%)居世界第二位，而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物的副反應(yīng)高達(dá)13%，在一些高齡，肝炎史，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)低下的患者中副反應(yīng)發(fā)生率更高，更嚴(yán)重[1]。如此高的患病率和高死亡數(shù)，令人難以承受，所以對(duì)結(jié)核病的防治和研究也一直是各國(guó)政府扶持的重點(diǎn)之一。

目前對(duì)M.tb的研究主要是運(yùn)用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作為抗原，誘導(dǎo)不同的免疫細(xì)胞(γδT細(xì)胞、CD3+細(xì)胞等)發(fā)生反應(yīng)，從而深入探究相關(guān)機(jī)制，以便于研制出新的疫苗或者抗結(jié)核藥物。例如M.tb的菌壁上含有大量的脂蛋白可以通過(guò)DC介導(dǎo)的MHCⅡ途徑上調(diào)IFN+CD4+細(xì)胞的表達(dá)，從而起到免疫保護(hù)作用[2]。由于此類(lèi)研究一般都要進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，而血清又是細(xì)胞體外培養(yǎng)中使用最廣泛的細(xì)胞培養(yǎng)基成分，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是良好的添加劑。目前最主要的選擇是動(dòng)物血清，如小牛血清，新生牛血清，以及胎牛血清等。因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少，所以胎牛血清的使用較為廣泛。然而FBS中依然存在可能的各種病毒，支原體和朊病毒等[3]。人AB型血清具有同源性，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[4]，滑膜細(xì)胞[5]，人結(jié)膜上皮細(xì)胞[6]，施萬(wàn)細(xì)胞[7]，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[8]等細(xì)胞的研究表明與胎牛血清相比，用人AB型血清培養(yǎng)的細(xì)胞能更好的促使細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，保持其特有功能。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪翘接憙煞N血清在PBMC增殖實(shí)驗(yàn)中的效果。

1材料與方法

1.1M.tb抗原及其配制

1.1.1抗原種類(lèi)由M.tbH37Rv株制備的全菌裂解物(H37Rv，Whole Cell Lysate，WCL，NR-14822)，由BEI Resources，美國(guó)國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所(NIAID)，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NIH)提供。

1.1.2抗原的配制WCL抗原采用無(wú)菌PBS稀釋至1 g·L-1。

1.2試劑和儀器淋巴細(xì)胞分離液，天津TBD公司；培養(yǎng)基RPMI1640，HyClone公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)購(gòu)于北京元亨金馬生物技術(shù)公司；人AB型血清，人白細(xì)胞濃縮液，安徽省合肥市紅十字中心血站；重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)BD公司；流式細(xì)胞儀FACSVerse，BD公司；植物血凝素(PHA)，sigma；熒光染料 CFSE，invirtrogen； PI，sigma。

1.3人AB型血清制取取AB型血漿(n=5)混合，滅活后先置于-20℃中50 min，室溫下溶解后，再置于離心機(jī)15 000 rpm，1 h，4℃。之后取上清液并凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4CFSE染色人白細(xì)胞濃縮液經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液獲得PBMC，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整至2×109·L-1的細(xì)胞懸液，加入CFSE(終濃度1 μmol·L-1)，37℃染色10 min后分別用含10%FBS的RPMI1640或10%AB血清的PRMI1640培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度至0.5×109·L-1。

1.5抗原刺激培養(yǎng)將CFSE染色后的PBMC培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中(圓底)每孔200 μL，設(shè)空白對(duì)照組，WCL組(20 mg·L-1)，陽(yáng)性組PHA(5 mg·L-1)，以及WCL加IL-2(50 U·mL-1)，該組IL-2每3 d補(bǔ)充一次，劑量相同。連續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.6細(xì)胞增殖分析(1)在培養(yǎng)初期至末期分別用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化。(2)至第6天，收集細(xì)胞，洗滌后加入PI(100 mg·L-1)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，通過(guò)淋巴細(xì)胞的大小以及PI的特點(diǎn)，用門(mén)(gate)圈取活的淋巴細(xì)胞，再根據(jù)CFSE的熒光強(qiáng)度對(duì)門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)分析采用Fcs Express軟件。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1外周血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)觀察各組在生長(zhǎng)第一天兩種血清培養(yǎng)下的PBMC無(wú)明顯區(qū)別，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞開(kāi)始分裂生長(zhǎng)，并逐漸形成集落。對(duì)照組生長(zhǎng)極為緩慢，至6 d時(shí)幾乎無(wú)明顯增長(zhǎng)。PHA組增長(zhǎng)則極為迅速至3 d時(shí)都以形成大團(tuán)集落，但至6 d時(shí)集落變小，提示可能細(xì)胞開(kāi)始死亡。至于WCL組初始無(wú)明顯區(qū)別，至6 d觀察，AB型血清組細(xì)胞增長(zhǎng)FBS組較為明顯，集落較多，也較密(圖1)。

注：A、C：AB型血清培養(yǎng)組；A：培養(yǎng)1 d，C：培養(yǎng)6 d;B、D：FBS組；B：培養(yǎng)1 d，D: 培養(yǎng)6 d。

2.2外周血單核細(xì)胞增殖檢測(cè)運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE的熒光強(qiáng)弱，分析淋巴細(xì)胞增殖情況，同時(shí)檢測(cè)PI以去除死細(xì)胞。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組情況(圖2)。結(jié)果：空白對(duì)照組的兩種血清組均無(wú)明顯增殖，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PHA刺激條件下FBS組(77.0±23.76)%的淋巴細(xì)胞較AB型血清組(62.96±17.75)%增殖效果好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在WCL刺激條件下，人AB型血清組(31.57±18.69)%(圖3A)的淋巴細(xì)胞要比FBS組(15.99±9.15)%(圖3B)的增殖效果好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，WCL加IL-2組中人AB型血清組(44.90±15.77)%(圖4A)的淋巴細(xì)胞比FBS組(30.79±13.27)%(圖4B)增殖效果好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*P<0.05 vs FBS組，control組n=13，PHA組n=11，WCL組n=13，WCL+IL-2組n=9。

注：A：AB型血清組；B：FBS組。

注：A：AB型血清組；B：FBS組。

3討論

由于M.tb是胞內(nèi)寄生菌，抗體無(wú)法進(jìn)入胞內(nèi)，所以人體對(duì)M.tb的免疫方式主要依靠細(xì)胞免疫，而細(xì)胞免疫多數(shù)都是依靠樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)或者巨噬細(xì)胞抗原呈遞給T細(xì)胞，從而激活效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生免疫效應(yīng)[9-10]。而在單獨(dú)培養(yǎng)的DC中，若添加人AB型血清或者自體血清后，培養(yǎng)后的DC無(wú)論是在功能，特異性表面分子(CD83,CD86等)的表達(dá)上均要優(yōu)于同等條件下添加胎牛血清或者無(wú)血清培養(yǎng)的DC[11]。此外在M.tb感染中IL-2、IL-4等細(xì)胞因子也起到了重要作用，特別是在未感染和已感染人群中存在顯著差異。對(duì)細(xì)胞因子的研究往往也需要進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，但是在體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，才能使得免疫細(xì)胞活化增殖，所以為了避免細(xì)胞過(guò)早死亡，就需要一種優(yōu)秀的添加劑。血清可以使得細(xì)胞在更好的環(huán)境中生長(zhǎng)，特別是在培養(yǎng)周期較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中，其效果更加明顯。雖然血清中的有些成分對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有利的影響，例如大分子的蛋白質(zhì)、核酸及營(yíng)養(yǎng)因子等，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、黏附及中和某些毒性物質(zhì)起著一定的作用，但是同時(shí)也含有一些會(huì)不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，例如當(dāng)球蛋白>20 g·L-1時(shí)，并在某些物質(zhì)的作用下，就會(huì)出現(xiàn)影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞毒性作用。通過(guò)添加人AB型血清可以適當(dāng)提高培養(yǎng)液中白蛋白的含量，降低球蛋白的含量，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。此外血清中含有的血小板原生長(zhǎng)因子(PDGF)可直接作用于細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，加速細(xì)胞的分裂和增殖[13]。而在人血清中的PDGF含量要高于其在FBS中的含量，這可能也是一個(gè)重要的因素[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，在PHA刺激條件下，F(xiàn)BS組淋巴細(xì)胞增殖較人AB型組多，可能是由于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)液不夠，使得人AB型血清組中的細(xì)胞在較早時(shí)就開(kāi)始死亡，而死亡細(xì)胞的成分又進(jìn)一步抑制其他細(xì)胞增殖。而實(shí)驗(yàn)組由于WCL不是有絲分裂原，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能使PMBC增殖。若是加入IL-2則能加快細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞的生長(zhǎng)。至于人AB型血清中是否還含有其他促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，或者是有能更好的促使M.tb裂解物誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化增殖的成分還待以后進(jìn)一步的深入研究。本實(shí)驗(yàn)表明在體外培養(yǎng)中，添加人AB型血清培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞對(duì)M.tbWCL刺激的增殖效果明顯，可以作為良好的細(xì)胞培養(yǎng)基成分。

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關(guān)于文稿中法定計(jì)量單位的書(shū)寫(xiě)要求

本刊法定計(jì)量單位實(shí)行國(guó)務(wù)院1984年2月頒布的《中華人民共和國(guó)法定計(jì)量單位》，并以單位符號(hào)表示，具體使用參照1991年中華醫(yī)學(xué)會(huì)編輯出版部編輯的《法定計(jì)量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》一書(shū)。注意單位名稱(chēng)與單位符號(hào)不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應(yīng)改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號(hào)中表示相除的斜線(xiàn)多于1條時(shí)，應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線(xiàn)和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計(jì)量單位處用括號(hào)加注與舊制單位的換算系數(shù)，下文再出現(xiàn)時(shí)只列法定計(jì)量單位。人體及動(dòng)物體內(nèi)的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現(xiàn)時(shí)用括號(hào)加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時(shí)間的表達(dá)，凡前面帶有具體數(shù)據(jù)者應(yīng)采用d、h、min、s，而不用天、小時(shí)、分鐘、秒。量的符號(hào)一律用斜體字母，如吸光度(舊稱(chēng)光密度)的符號(hào)為A,“A”為斜體字。

Comparsion of Mycobacterium tuberculosis Whole Cell Lysate effects on

proliferation of human peripheral blood mononucelear cells in

human AB type serum and fetal bovine serum

JIN Liang,ZHANG Xi,SHA Quan

(DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,

AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the proliferation difference of human peripheral blood mononucelear cells (PBMCs) which were stimulated with Mycobacterium tuberculosis (M.tb) Whole Cell Lysate (WCL) in human AB serum cell culture medium and fatal bovine serum (FBS) cell culture medium.MethodsPBMCs from healthy adults were stimulated by WCL or WCL with recombinant human interleukin 2 ( rhIL-2) or phytohemagglutinin (PHA) or none as control in four groups.Each of the groups was cultured with RPMI-1640 medium containing 10% AB serum or 10% FBS for six days respectively.The proliferation of lymphocytes was carefully investigated under the inverted microscope and flow cytometry.ResultsThe proliferation of lymphocytes stimulated by WCL in medium with 10% AB serum is better than that in medium with 10% FBS (P<0.05).Similar results were obtained when PBMCs were stimulated by WCL and rhIL-2 (P<0.05) .ConclusionWhen human PBMCs were stimulated withM.tbWCL,the proliferation of lymphocytes was better in the culture medium supplemented with human AB serum than in that with FBS serum.

Key words:mycobacterium tuberculosis;AB type of human serum;fetal bovine serum;PBMC

(收稿日期：2014-05-15，修回日期：2014-08-07)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.021

通信作者：沙泉，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：過(guò)敏與氣道免疫，E-mail：qsha2@yahoo.com

作者簡(jiǎn)介：金亮，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No 81273245);安徽省國(guó)際科技合作計(jì)劃(No 11030603027)