張文雋，吳亞召，雷 萍，杜 芳

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

秦巴山區(qū)野生桑黃rDNA ITS序列及親緣關(guān)系分析*

張文雋，吳亞召，雷 萍**，杜 芳

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

對(duì)采自秦巴山區(qū)的6株野生桑黃菌，進(jìn)行rDNA ITS區(qū)段克隆測(cè)序和序列特征比較分析，并對(duì)其rDNA ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank同源性檢索比對(duì)，將從GenBank檢索獲得的18個(gè)最相似物種的ITS序列連同6個(gè)不同桑黃菌株的ITS序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H與Inonotus linteus親緣關(guān)系最近，相似性分別為98.23%、98.23%、98.10%、98.23%、98.23%，其序列長(zhǎng)度均為757 bp；桑-H1與Fuscoporia qilva親緣關(guān)系最近，相似性為95.90%，其序列長(zhǎng)度均為796 bp。

桑黃；rDNA ITS；序列分析；親緣關(guān)系

桑黃屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、銹革孔菌科 （Hymenochaeyaceae）、針層孔菌屬（Phellinus）[1]，屬內(nèi)又分為火木層孔菌（P.igniarius）、鮑氏針層孔菌（P.baumii） 和裂蹄木層孔菌（P.linteus）[2]，是近幾年開(kāi)發(fā)的一種多年生的珍貴藥用真菌，有“森林黃金”之美稱(chēng)。據(jù)《中藥大辭典》記載，其可治血崩、血淋、帶下、閉經(jīng)等婦科疾病[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其抗癌、抗菌、抗纖維化、抗氧化等效果顯著，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工、保健品等行業(yè)。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，國(guó)外特別是日本和韓國(guó)權(quán)威醫(yī)藥機(jī)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)桑黃抗腫瘤、抗菌、抗纖維化、抗氧化等效果顯著，是目前公認(rèn)的生物領(lǐng)域治療腫瘤有效率排在第1位的高等真菌[4]。近年來(lái)，人們將藥用菌桑黃作為一種重要生物資源，應(yīng)用于抗腫瘤產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，在科技界和實(shí)業(yè)界都傾注了很高的熱情。

桑黃來(lái)源于菌物的子實(shí)體，在真菌傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)中，由于不同桑黃真菌間子實(shí)體形態(tài)差異較小，使得依賴(lài)于形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定較為困難，頻頻出現(xiàn)“同物異名”、“同名異物”的現(xiàn)象，造成了名稱(chēng)和應(yīng)用上的混亂。根據(jù)文獻(xiàn)記載不是每個(gè)俗名叫“桑黃”的都有藥效，目前據(jù)資料報(bào)道鮑氏針層孔菌（P.baumii）、裂蹄針層孔菌（P.linteus）以及火木層孔菌（P.igniarius）等幾種可入藥。為此，對(duì)獲得的6株桑黃菌株進(jìn)行了基于rDNA ITS序列的分子鑒定，對(duì)更好的認(rèn)識(shí)和利用秦巴山區(qū)野生桑黃具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的桑-W、桑-H、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H1六株菌株，為陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室采集的秦巴山區(qū)野生桑黃子實(shí)體，通過(guò)組織分離獲得。

對(duì)分離獲得的菌種純培養(yǎng)物進(jìn)行取樣檢測(cè)。菌株編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試桑黃菌株的編號(hào)及來(lái)源Tab.1 Strain No.and fruit body collection site

1.2 方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

將保藏菌種取出活化后，接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基（300 mL三角瓶）中，每個(gè)菌株各接3瓶，28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，紗布過(guò)濾，蒸餾水沖洗2次，滅菌紙吸干后，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

取0.2 g～0.5 g菌絲體，用植物基因組提取DNA試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌絲體的基因組DNA，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 ITS序列擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR擴(kuò)增ITS序列，引物為ITS1：TCCGTAG GTGAACCTGCG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAT GC，由上海生工生物工程股份有限公司合成。20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：Genomic DNA（1 μL）、ITS1（0.5 μL）、ITS4（0.5 μL）、2×Mix（10 μL）、dd H2O（8 μL）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃反應(yīng)5 min；95℃反應(yīng)30 s，55℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)7 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 rDNA ITS序列克隆和測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，以PCR純化試劑盒回收后連接入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。每個(gè)樣品均隨機(jī)挑選5個(gè)陽(yáng)性克隆，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，所得序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，利用分析軟件MEGA4.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取及ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

樣品基因組DNA提取電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣品基因組DNA提取電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The test results of genomic DNA extraction electrophoresis

由圖1可以看出，以桑黃搖床培養(yǎng)菌絲為出發(fā)材料，參照天根生化科技有限公司的植物基因組提取DNA試劑盒提取方法，所得基因組DNA經(jīng)瓊脂糖電泳主帶清晰，無(wú)拖尾、降解現(xiàn)象，質(zhì)量好，完全能滿(mǎn)足后續(xù)PCR擴(kuò)增對(duì)樣品基因組DNA質(zhì)量的要求。樣品rDNA ITS序列擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，以桑黃菌絲體基因組DNA為模板，ITS1、ITS4為引物，PCR擴(kuò)增出的目的片段條帶單一清晰，6個(gè)測(cè)試樣品擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分布在750 bp～800 bp范圍內(nèi)。

圖2 樣品rDNA ITS序列擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The test results of rDNA ITS sequence amplification electrophoresis

2.2 桑黃rDNA ITS序列分析

對(duì)桑黃rDNA ITS擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序，用DNA Man軟件分析6個(gè)樣品序列精確長(zhǎng)度，桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H均為757 bp，桑-H1為796 bp。通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST同源性比對(duì)，桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H與Inonotus linteus最為接近，相似性分別為98.23%、98.23%、98.10%、98.23%、98.23%；桑-H1與Fuscoporia qilva最為接近，相似性為95.90%。

2.3 基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

基于rDNA ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，依據(jù)rDNA ITS序列信息進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H與Inonotus linteus聚在一起，桑-H1與Fusco poria qilva聚在一起。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)得到的結(jié)果與供試菌株rDNA ITS全序列信息分析結(jié)果表現(xiàn)出較高的一致性，進(jìn)一步說(shuō)明了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的可靠性。

3 討論

ITS rDNA區(qū)進(jìn)化速率較快，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，對(duì)高等植物和大型真菌鑒定有更好的準(zhǔn)確性和靈敏性，適用于不同分類(lèi)水平的物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[5-6]。由于桑黃真菌各物種間形態(tài)差異不大，通過(guò)形態(tài)鑒定較為困難。利用rDNA ITS序列分析技術(shù)，可以直接提取蘊(yùn)含于基因組內(nèi)的遺傳信息，檢測(cè)和比較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)無(wú)法區(qū)分的相似菌株種間或種內(nèi)差別，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

本研究應(yīng)用ITS序列分析技術(shù)，對(duì)6株桑黃菌rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行克隆測(cè)序，并在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示，桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H與Inonotus linteus（裂蹄木層孔菌）最為接近，相似性分別為98.23%、98.23%、98.10%、98.23%、98.23%，其序列長(zhǎng)度均為757 bp；桑-H1與Fuscoporia qilva最為接近，相似性為95.90%，其序列長(zhǎng)度均為796 bp。因此，可以確定桑-W、桑-F、桑-D、桑-Y、桑-H是裂蹄木層孔菌（也稱(chēng)Phellinus linteus），5株菌是可以入藥的桑黃菌。

圖3 基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

[1]張小青，戴玉成.中國(guó)真菌志 [M]．北京：科學(xué)出版社，2005：117-191.

[2]劉艷芳，楊焱，賈薇，等.藥用真菌桑黃總黃銅測(cè)定方法研究 [J]．食用菌學(xué)報(bào)，2006，13（2）：45-48.

[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典 [M]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1995，1976.

[4]Iikekawa T,Nakanishi M,Uehara N.Antitumor action of some basidiomycetes，especially Phellinus linteus[J].Gann(Japanese Journal of Cancer Research)，1968，59（9）:155-157.

[5]王建波，張文駒，陳家寬.核rDNA的ITS序列在被子植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的應(yīng)用 [J].植物分類(lèi)學(xué)報(bào)，1999，37（4）：407-416.

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Analysis on Sequence and Genetic Relationship of rDNA ITS of Wild Phellinus in Qinba Mountains

ZHANG Wen-jun,WU Ya-zhao,LEI Ping,DU Fang
（Shaanxi Microbioogy Rereach Institute,Xi’an 710043,China）

The ITS sequences of six wild Phellinus strains from Qiaba mountain district were sequenced and analyzed by ITS method.Moreover,ITS sequences were followed by sequence comparison with GenBank database using the basic local alignment search tool algorithm.The retrieval sequences of 18 most similar species along with six different Phellinus strains was analyzed for system development.Results showed Inonotus linteus with Sang-W,Sang-F,Sang-D,Sang-Y and Sang-H had closest genetic relationship,the similarity was 98.23%，98.23%，98.10%，98.23%，98.23%,respectively,and the sequence length was 757 bp.Inonotus linteus with Sang-H had the most similarity with Fuscoporia qilva(95%).The sequence length was 796 bp.

Phellinus;rDNA ITS;sequence analysis;genetic relationship

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0050-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.014

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013JM3021）；陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2013K01-22）；西安市科技局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新計(jì)劃 [NC1320（1）]；西安市科技局技術(shù)轉(zhuǎn)移促進(jìn)工程 [CXY1348（4）]；陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2014K-14）；陜西省科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目與產(chǎn)業(yè)化專(zhuān)項(xiàng)（2013K-03）。

張文雋（1977-）女，碩士，助理研究員，主要從事藥用真菌研究與開(kāi)發(fā)。

**通信作者：雷萍（1966-），女，本科，副研究員，主要從事藥用真菌研究與開(kāi)發(fā)。E-mail:wuleiping2529@126.com

2014-11-16