吳圣進(jìn)，王燦琴，汪 茜，韋仕巖

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007）

草菇生長發(fā)育過程中胞外酶活性變化*

吳圣進(jìn)，王燦琴，汪 茜，韋仕巖

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007）

對(duì)9個(gè)草菇菌株生長發(fā)育過程中的胞外羧甲基纖維素酶（CMCase）、木聚糖酶（Xylase）和漆酶（Laccase）活性變化進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果表明，不同菌株的胞外酶活性變化規(guī)律基本一致，其中CMCase和Xylase活性都在菌絲期最高，此后呈下降趨勢，僅Xylase活性在蛋形期時(shí)有所上升；Laccase活性則在菌絲期最低，針頭期迅速上升，紐扣期時(shí)達(dá)最高，此后又迅速降低。不同菌株間的CMCase和Xylase活性在菌絲期有明顯差異，而Laccase活性則在針頭期和紐扣期的差異最大。生物學(xué)效率較高的菌株V9、V112和V木-2在菌絲期CMCase和Xylase活性較高，并在針頭期和紐扣期Lac case活性很高。

草菇；胞外酶；活性變化

草菇（Volvariella volvacea），是一種具有極高營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的大型食用菌真菌，為高溫型食用菌，盛產(chǎn)于我國南方地區(qū)，總產(chǎn)量在人工栽培的食用菌品種中位列前10名[1]。

栽培草菇常用原料有棉籽殼、廢棉、稻草、玉米秸稈、玉米芯等草質(zhì)纖維原料，主要組成成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，這些大分子物質(zhì)只有在相應(yīng)水解酶作用下分解為小分子物質(zhì)才能被草菇吸收利用。草菇為草腐類真菌，擁有較完備的纖維素酶系和半纖維素酶系[2-3]，而木質(zhì)素降解酶系較欠缺，被認(rèn)為缺少漆酶、錳過氧化物酶和脂質(zhì)過氧化物酶等木質(zhì)素降解酶類[4-5]，因此更適合在木質(zhì)素含量低的纖維材料上生長。但近年來更多研究表明，草菇具一定漆酶活性[6-7]。草菇胞外木質(zhì)纖維素酶活性對(duì)其生物轉(zhuǎn)化率具有重要影響，擁有較高酶活性的菌株，子實(shí)體產(chǎn)量也往往更高[8]，因此酶活性大小作為一個(gè)衡量指標(biāo)，可用于草菇高產(chǎn)菌株的篩選。食用菌胞外酶活性在其生育期內(nèi)處于動(dòng)態(tài)變化中[9-12]，它們的變化直接反映食用菌各生育期的營養(yǎng)生理需求。本研究對(duì)草菇不同生育期胞外木質(zhì)纖維素酶活性進(jìn)行測定，以了解其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，從而為更好地利用酶活性指標(biāo)進(jìn)行草菇高產(chǎn)菌株選育和高效生產(chǎn)調(diào)節(jié)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

草菇菌株V木-2、V蚌、V廣、V5、V9、V10、V26、V112、V365，均來自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物所的保存菌株。

1.1.2 原材料

木薯渣由廣西武鳴縣鑼圩酒精廠提供，木薯酒精渣自然風(fēng)干后使用；棉籽殼、麥麩、石灰等材料市場上購買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草菇栽培試驗(yàn)

采用熟料袋栽方法，栽培原料為木薯渣180 kg、棉籽殼180 kg、石膏4 kg、石灰12 kg。原料加水拌勻，水分調(diào)節(jié)為65%左右，堆制好后用薄膜覆蓋3 d；添加麥麩40 kg，再拌勻，調(diào)節(jié)pH為8。原料配制好后用17 cm×35 cm×0.04 cm高壓聚丙烯栽培袋裝料，每袋裝原料約1 kg（折合干料重約350 g），扎緊袋口，常壓滅菌8 h。滅菌后等袋內(nèi)原料溫度降至40℃，按照3%接種量接種，其中每一草菇菌株各接種80袋；接種后移入培養(yǎng)室內(nèi)避光培養(yǎng)。菌絲生長階段氣溫為24℃～35℃，空氣相對(duì)濕度70%左右；菌絲滿袋后移入出菇房，開袋口，并齊培養(yǎng)料剪去袋口塑料袋，準(zhǔn)備出菇。出菇溫度28℃～35℃，空氣相對(duì)濕度90%左右，光照強(qiáng)度80 lx～100 lx，每天通風(fēng)2次～3次。在草菇長至蛋形期時(shí)采收，并分別統(tǒng)計(jì)每一草菇菌株的子實(shí)體產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率（P），公式為：

式中：M表示草菇子實(shí)體鮮重；M1表示栽培原料干重。

1.2.2 樣品采集

分別在草菇菌絲期（菌棒菌絲長滿2/3）、原基期、紐扣期、蛋形期和成熟期采樣。采樣時(shí)，每一菌株隨機(jī)抽取3袋菌棒，每一菌棒先去除舊種、原基和子實(shí)體，再刮去表層約厚1 cm的培養(yǎng)料，取表層下2 cm～5 cm深度的菌曲約100 g，混勻，密封于塑料袋，置于-20℃保存。

1.2.3 粗酶液的提取

取草菇固體曲樣品10 g于容量250 mL的三角瓶，加入40 mL提取液（50 mmol·L-1KHPO4緩沖液，pH6.5），在28℃、150 r·min-1下?lián)u床浸提2 h，4層紗布?jí)赫ミ^濾，所得濾液進(jìn)一步在4℃、1×104r·min-1下離心30 min，上清液即為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 木質(zhì)纖維素酶活測定

纖維素酶（CMCase） 和木聚糖酶（Xylanase）的測定參考包衎等[13]的方法，移取適當(dāng)稀釋的酶液0.5mL于試管中（空白對(duì)照用0.5 mL無菌水替代酶液），加入含0.5%羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）或者1%橡木木聚糖的檸檬酸緩沖液（0.05 mol·L-1，pH4.5） 1.5 mL，然后在50℃水浴鍋中準(zhǔn)確作用30 min后，加入DNS試劑2.0 mL，搖勻，置于沸水中煮沸10 min，取出置于冷水中冷卻，在722型分光光度計(jì)上比色（UV-1600型分光光度儀，北京瑞利分析儀器公司），在520 nm（或540 nm）用1 cm比色皿比色，測得OD值，查閱葡萄糖（或木糖）標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得含糖量。定義每分鐘催化CMC-Na（或木聚糖）水解生成1 μmol葡萄糖（或木糖）的酶量為1個(gè)酶活力單位“IU”。漆酶（Laccase）的測定參考雷德柱等[7]，3mL反應(yīng)總體積中，加入適當(dāng)稀釋的酶液0.3 mL、0.1 mol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）2.5 mL、5 mmol·L-1的ABTS 0.2 mL，室溫下反應(yīng)5 min，測定反應(yīng)液在420 nm處吸光值。定義每分鐘使吸光度增加0.001所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

草菇生物學(xué)效率為50袋菌棒的平均值。酶活和菌絲生長速度為隨機(jī)抽取的3袋菌棒即3個(gè)重復(fù)的平均值。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較（Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇不同生育期的纖維素酶活性

草菇不同生育期的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性變化見圖1。

圖1 草菇不同生育期的纖維素酶活Fig.1 Actitities of CMCase of Volvariella volvacea at different growth stage

被測的9個(gè)草菇菌株在菌絲期CMCase活性最高，并隨著生育期由菌絲期、針頭期、紐扣期、蛋形期至成熟期發(fā)展，CMCase活性呈逐漸下降的趨勢，其中菌絲期至針頭期下降較緩，至紐扣期時(shí)酶活性下降幅度最大，蛋形期下降幅度小，部分菌株（如V蚌和V9）在蛋形期的酶活性有所上升。菌絲期、針頭期、紐扣期、蛋形期至成熟期的CMCase活性范圍分別為：10.0 IU·g-1·DW～15.3 IU·g-1·DW、9.0 IU·g-1·DW～14.1 IU·g-1·DW、6.4 IU·g-1·DW～10.7 IU·g-1·DW、5.0 IU·g-1·DW～10.3 IU·g-1·DW、4.2 IU·g-1·DW～8.0 IU·g-1·DW。不同菌株的CMCase活性變化幅度不同，其中菌株V9、V112和V木-2的酶活性變化幅度大，在菌絲期和針頭期處于最高水平，達(dá)12.7 IU·g-1·DW～15.0 IU·g-1·DW，但在蛋形期以后處于較低水平。

2.2 草菇不同生育期的半纖維素酶活性

草菇不同生育期的半纖維素酶（木聚糖酶，Xylase）活性變化見圖2。

圖2 草菇不同生育期的半纖維素酶活Fig.2 Activities of Xylase of Volvariella volvacea at different growth stage

測定的9個(gè)菌株的木聚糖酶活性均在菌絲期達(dá)到最高，至針頭期時(shí)急速下降，紐扣期的酶活性繼續(xù)下降，但下降幅度變小，至蛋形期酶活性有所上升或維持不變，但成熟期的酶活性又急速下降。各菌株在菌絲期、針頭期、紐扣期、蛋形期和成熟期的Xylase活性范圍分別為：17.8 IU·g-1·DW~28.4 IU·g-1·DW、14.0 IU·g-1·DW~18.3 IU·g-1·DW、11.5 IU·g-1·DW~14.5 IU·g-1·DW、11.7 IU·g-1·DW~18.9 IU·g-1·DW、6.7 IU·g-1·DW~12.3 IU·g-1·DW。各菌株Xylase活性在菌絲期差異最大，其中酶活性較高的有V5、V112、V9、V木-2、V26和V10，酶活性較低的有V蚌、V廣和V365。針頭期和紐扣期各菌株間酶活性差異較小。菌株V9、V112和V木-2酶活性在菌絲期和針頭期處于較高水平，紐扣期及之后則處于較低水平。

2.3 草菇不同生育期的漆酶活性

草菇不同生育期的漆酶活性變化見圖3。

各菌株漆酶活性在菌絲期最低，之后隨生育期進(jìn)程急速上升，至紐扣期達(dá)最高，蛋形期時(shí)則急速下降，成熟期又有所回升。菌絲期時(shí)，各菌株的漆酶活性差異不明顯，而在針頭期和紐扣期，菌株V9、V112和V木-2的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它菌株。

2.4 草菇不同菌株的菌絲長勢和生物學(xué)效率

對(duì)9個(gè)草菇菌株的菌絲生長速度、長勢及其生物學(xué)效率進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

圖3 草菇不同生育期的漆酶活性Fig.3 Activities of Laccase of Volvariella volvacea at different growth stage

表1 不同草菇菌株的菌絲長勢和生物學(xué)效率Tab.1 Mycelium growth and biological efficiency of different Volvariella volvacea strains

由表1可見，V9、V112、V365和V10菌絲生長速度最快，V5、V廣、V26和V蚌次之，V木-2最慢；V9、V112和V蚌菌絲長勢最強(qiáng)，菌絲濃密潔白，V木-2的菌絲長勢最差，菌絲稀疏；V9、V112和V木-2的生物學(xué)效率最高，為26.1%～31.8%，V蚌和V365次之，分別為18.3%和16.5%，V5的生物學(xué)效率最低，僅8.5%。

3 結(jié)果與討論

食用菌生長發(fā)育過程中依賴菌絲細(xì)胞分泌的多種胞外酶水解環(huán)境中大分子有機(jī)物，維持其生命過程，生育期內(nèi)胞外酶活性的動(dòng)態(tài)變化反映了不同時(shí)期的營養(yǎng)需求。本研究結(jié)果表明，草菇CMCase和Xylase活性均在菌絲期達(dá)到最高，并隨著生育期的進(jìn)展而逐漸下降，表明草菇菌絲期對(duì)養(yǎng)分的需求最大；Xylase活性在蛋形期有所回升，這一時(shí)期由于子實(shí)體快速膨大，對(duì)養(yǎng)分的需求也增加。但是，Ding等[14]在檢測草菇內(nèi)切葡聚糖酶基因eg1和eg2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)高峰均出現(xiàn)在蛋形期至成熟期，而在菌絲定殖期轉(zhuǎn)錄水平很低，與本研究中胞外CMCase活性變化趨勢相反。由于草菇至少存在5個(gè)以上的內(nèi)切葡聚糖酶[5]，其胞外酶活性是多個(gè)同工酶的總體表現(xiàn)，僅憑1個(gè)～2個(gè)酶的表達(dá)水平可能無法反映該酶的總體水平。此外，胞外酶活性還受基因翻譯水平、酶胞外分泌水平等諸多因素影響，這也可能是結(jié)果不一致的原因。菌絲期出現(xiàn)纖維素酶和半纖維素酶活性高峰的現(xiàn)象在其他非木腐類食用菌中也有發(fā)現(xiàn)，如大球蓋菇[12]和柱狀田頭菇[9]的CMCase和Xylase活性高峰均出現(xiàn)在菌絲定殖時(shí)期。也有研究發(fā)現(xiàn)，非木腐類食用菌姬松茸[15]和四孢蘑菇[16]的CMCase和Xylase活性低峰對(duì)應(yīng)菌絲期，高峰對(duì)應(yīng)子實(shí)體成熟期，與本研究中草菇的正好相反，但它們都利用發(fā)酵料栽培，不能排除原料中其他微生物對(duì)酶活性的貢獻(xiàn)。草菇與木腐類食用菌的CMCase和Xylase活性變化規(guī)律則完全不同。據(jù)報(bào)道，姬菇、鮑魚菇[17]、金頂側(cè)耳[18]和灰樹花[10]等木腐型食用菌的CMCase和Xylase活性高峰均出現(xiàn)在子實(shí)體成熟期，而菌絲定殖期的活性最低。同時(shí)，這些食用菌的漆酶均在菌絲定殖期間活性很高，而子實(shí)體發(fā)生與生長期很低，這被認(rèn)為是優(yōu)先降解木質(zhì)素以便釋放被束縛的纖維素所需。本研究中草菇漆酶活性卻在菌絲期很低，針頭期急速上升，紐扣期達(dá)到高峰，這與Chen等[6]的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為草菇漆酶可能與子實(shí)體形態(tài)建成有關(guān)，而不是行使其降解木質(zhì)素的功能。漆酶在草菇降解木質(zhì)纖維素過程中的作用還有待進(jìn)一步研究，總之，漆酶對(duì)草菇子實(shí)體的發(fā)育都有重要影響。

本研究中，不同草菇菌株的胞外酶活性變化趨勢基本一致，但菌株間的酶活性大小存在差異，其中菌株間的CMCase活性差異在整個(gè)生育期都較明顯，Xylase活性差異最明顯的時(shí)期為菌絲期，而Laccase活性差異最明顯的時(shí)期為針頭期和紐扣期。Ahlawat等[8]認(rèn)為胞外酶活性可作為篩選草菇高產(chǎn)菌株的衡量指標(biāo)，因?yàn)閾碛休^高酶活性的菌株子實(shí)體產(chǎn)量也往往更高。本研究中菌株V9、V112和V木-2擁有最高的生物學(xué)效率，菌絲長勢也最強(qiáng)（V木-2除外），相對(duì)應(yīng)，它們?cè)诰z期和針頭期擁有相對(duì)較高的CMCase和Xylase活性，以及在針頭期和紐扣期擁有遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株的Laccase活性，與上述論斷相符。但是，這些胞外酶在其他發(fā)育時(shí)期的活性卻無明顯的比較優(yōu)勢，相對(duì)更低些，說明利用胞外酶活性作為草菇高產(chǎn)性能的衡量指標(biāo)時(shí)應(yīng)確定好對(duì)應(yīng)的生育期。本研究結(jié)果表明，菌絲期至針頭期的CMCase和Xylase和針頭期至紐扣期的Laccase活性指標(biāo)可能最能反映草菇菌株的高產(chǎn)性能。

綜上所述，草菇CMCase和Xylase的活性高峰出現(xiàn)在菌絲定殖時(shí)期，它們對(duì)纖維素和半纖維素的高效分解作用可為草菇菌絲的定殖提供更多的養(yǎng)分，該時(shí)期的養(yǎng)分累積可能是后期草菇子實(shí)體發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要基礎(chǔ)；草菇Laccase活性在針頭期和紐扣期最高，可能對(duì)子實(shí)體的形態(tài)建成和發(fā)育產(chǎn)生作用，并最終影響草菇子實(shí)體產(chǎn)量。本研究結(jié)果為草菇高產(chǎn)菌株的選育和生產(chǎn)調(diào)控提供了依據(jù)。

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Extracellular Enzyme Production by Volvariella volvacea During Its Growth and Development

WU Sheng-jin,WANG Can-qin,WANG Qian,WEI Shi-yan
（Institute of Microbiology,Guangxi Academic of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China）

Activities of extracellular CMCase,Xylase and Lccase of 9 Volvariella volvacea strains were detected during their growth and development.The results showed that the changes of extracellular enzymes activity on different growth stages were similar among the strains.The activity peaks of CMCase and Xylase occurred at the stage of mycelial growth and decreased gradually thereafter,exceptionally an increase in activity of Xylase at egg stage.The Laccase activity was at the lowest level at the stage of mycelial growth,but greatly increased and reached the highest level during the pinhead stage and button stage,and greatly decreased thereafter.Among strains of Volvariella volvacea,the obvious difference in activities of CMCase and Xylase were found at the stage of mycelial growth,while that of the Laccase activity was at the pinhead and button stage.Strain V9,V112and V木-2had the higher biological efficiency,and also had the higher activity of CMCase and Xylase at the stage of mycelial growth and much higher activity of Laccase at the pinhead and button stage.

Volvariella volvacea;extracellular enzymes;activity changes

S646.1

A

1003-8310(2015)01-0053-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.015

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)重點(diǎn)項(xiàng)目（桂農(nóng)科2013YZ18）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013GXNSFAA019066）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系廣西食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)。

吳圣進(jìn)（1973-），男，博士，副研究員，主要從事食用菌品種選育和栽培技術(shù)研究。E-mail：gxwusj@gxaas.net

2014-11-28