饑餓素對(duì)貧鈾所致MC3T3-E1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

郝玉徽，黃嘉偉，劉　聰，李　蓉　(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所，重慶 400038)

饑餓素對(duì)貧鈾所致MC3T3-E1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

郝玉徽，黃嘉偉，劉聰，李蓉(第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所，重慶 400038)

[摘要]目的評(píng)價(jià)饑餓素對(duì)貧鈾(DU)所致成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)損傷的影響。方法不同濃度的饑餓素提前1 h預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞后暴露于DU(500 μM)24 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)、堿性磷酸酶(AKP)、骨保護(hù)素(OPG)、可溶性核因子-κB受體活化因子配體(sRANKL)含量以及細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)和活性氧(ROS)水平。結(jié)果饑餓素預(yù)處理可明顯提高DU暴露后細(xì)胞存活率及CAT含量，降低細(xì)胞內(nèi)StrACP、AKP、sRANKL/OPG以及ROS水平，并且存在劑量依賴關(guān)系。結(jié)論饑餓素通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL系統(tǒng)的失衡以及降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，發(fā)揮對(duì)DU暴露后MC3T3-E1細(xì)胞的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]饑餓素；貧鈾；成骨細(xì)胞；活性氧

貧鈾(depleted uranium，DU)是天然鈾經(jīng)過提煉濃縮核燃料-鈾(235U)之后的剩余產(chǎn)物，其235U含量低于0.72%，主要由238U構(gòu)成，具有放射毒性和重金屬毒性雙重作用，但主要危害在于其重金屬毒性[1]。骨骼是DU慢性暴露的主要蓄積器官，骨鈾含量可作為評(píng)估慢性鈾暴露的主要指標(biāo)。朱國英等[2]研究表明，DU片嵌入損傷可致骨量明顯降低、骨生物力學(xué)性能下降、骨組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，并存在劑量和時(shí)間效應(yīng)。然而目前為止，幾乎沒有關(guān)于DU引起骨損傷的救治研究。

饑餓素(Ghrelin)是一種含有28個(gè)氨基酸殘基的腦腸肽，主要由由胃腸道分泌[3]，其可明顯減輕10 Gy電離輻射所引起的大鼠腸道細(xì)胞的凋亡[4]。有研究顯示，饑餓素可調(diào)節(jié)骨代謝和骨細(xì)胞的功能，并能夠抑制成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)[5]。然而，饑餓素對(duì)DU引起骨損傷的影響還未見報(bào)道。本研究通過成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)暴露于DU建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從骨代謝、骨保護(hù)素(OPG)/核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)系統(tǒng)調(diào)節(jié)及氧化應(yīng)激等方面初步探究饑餓素對(duì)DU所致MC3T3-E1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1主要試劑及配制

貧鈾溶液的制備：配制成質(zhì)量濃度為25 mg/mL的溶液，取500 mg的DU片(238U占99.75%，235U占0.2%及痕量234U)，溶于5 mL硝酸中，微熱，溶解，雙蒸水稀釋至20 mL(配好后調(diào)pH至中性)。過濾滅菌，4 ℃保存，備用。

MC3T3-E1細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，饑餓素購自成都凱捷生物技術(shù)有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所。OPG檢測(cè)試劑盒、可溶性核因子-κB受體活化因子配體(sRANKL)檢測(cè)試劑盒購自上海生工。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購自東仁化學(xué)科技公司。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清購自Gibco公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞株用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試驗(yàn)分析細(xì)胞存活將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，接種量為2×104個(gè)/孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為以下幾組：對(duì)照組(control組，不作任何處理)，貧鈾組(DU組，加入貧鈾溶液，使培養(yǎng)液中貧鈾濃度最終達(dá)到500 μM)，饑餓素處理組(DU+G 0.01、DU+G 0.1、DU+G 1、DU+G 10、DU+G 100組，培養(yǎng)液中加入饑餓素使其最終濃度分別達(dá)到0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM，1 h后再加入貧鈾溶液使其最終濃度達(dá)到500 μM)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸干培養(yǎng)液后加入含10 μl CCK-8 的新鮮培養(yǎng)液100 μl，孵育1 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光值(OD值) ，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白OD值)/(對(duì)照組OD值-空白OD值)×100%。其中空白組為單純培養(yǎng)基加上CCK-8 試劑。

1.2.3細(xì)胞提取液制備將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，接種量為106個(gè)/瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組情況與1.2.2相同，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。4 ℃ 600 g離心5 min收集細(xì)胞，除去上清，PBS洗滌1次，除去上清，按照每200萬細(xì)胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000～20 000 g離心15 min，吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細(xì)胞內(nèi)StrACP、AKP、OPG、sRANKL、CAT的測(cè)定分別按照相關(guān)試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞提取液中StrACP、AKP、OPG、sRANKL、CAT的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，接種量為2×105個(gè)/孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組情況與1.2.2相同，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入2 mL濃度為10 μM的熒光探針DCFH-DA工作液，37 ℃孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1饑餓素對(duì)DU暴露后細(xì)胞存活率的影響

MC3T3-E1細(xì)胞暴露于DU(500 μM)24 h后，DU組與control組相比存活率顯著降低(P<0.05)，饑餓素處理組(DU+G0.01～DU+G100組)與DU組相比存活率明顯升高(P<0.05)，且細(xì)胞存活率隨饑餓素濃度濃度的增高逐漸增高(圖1)。本結(jié)果表明饑餓素對(duì)DU暴露后的MC3T3-E1細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用。

*：與DU組相比，P<0.05

2.2饑餓素對(duì)DU暴露后骨代謝的影響

如圖2所示，正常情況下MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)StrACP處于較低水平，暴露于DU(500 μM)24 h后，DU組與control組相比，StrACP水平顯著上升(P<0.05)，而饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比，StrACP水平明顯下降(P<0.05)，且StrACP水平隨饑餓素濃度的增高逐漸降低；同時(shí)，DU組與control組相比，AKP水平顯著上升(P<0.05)，饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比AKP水平明顯下降(P<0.05)，且AKP水平隨饑餓素濃度的增高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

*：與DU組相比，P<0.05

2.3饑餓素對(duì)DU暴露后骨代謝OPG/RANKL系統(tǒng)的影響

如圖3所示，正常情況下MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)sRANKL處于較低水平，暴露于DU(500 μM)24 h后，DU組與control組相比，sRANKL水平顯著上升(P<0.05)，而饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比，sRANKL水平明顯下降(P<0.05)，且sRANKL水平隨饑餓素濃度的增高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；同時(shí)DU組與control組相比，OPG水平顯著下降(P<0.05)，饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比，OPG水平明顯升高(P<0.05)，且OPG水平隨饑餓素濃度的增高逐漸增高。對(duì)于sRANKL/OPG，DU組與control組相比顯著上升(P<0.05)，饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比，sRANKL/OPG水平明顯下降(P<0.05)，且sRANKL/OPG水平隨饑餓素濃度的增高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

*：與DU組相比，P<0.05；#：組間兩兩比較，P<0.05

2.4饑餓素對(duì)DU暴露后細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

MC3T3-E1細(xì)胞暴露于DU(500 μM)24 h后，DU組與control組相比，CAT水平顯著降低(P<0.05)，而饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比，CAT水平明顯升高(P<0.05)，且CAT水平隨饑餓素濃度的增高逐漸增高(圖4)。

*：與DU組相比，P<0.05；#：組間兩兩比較，P<0.05

2.5饑餓素對(duì)DU中毒后ROS的影響

如圖5所示，正常情況下細(xì)胞ROS活性低，在熒光顯微鏡下觀察并不明顯，DU組細(xì)胞ROS活性與正常組相比明顯升高，而饑餓素處理組(DU+G1、DU+G10、DU+G100組)與DU組相比ROS活性逐步降低。

3討論

針對(duì)DU中毒的救治，目前研究多重視通過合成螯合劑進(jìn)行體內(nèi)鈾的促排，探索出一系列的藥物[6-7]，并認(rèn)為具有明顯的DU促排效果。但是，促排藥的使用還有一定的爭(zhēng)議，因?yàn)樗鼈兒外櫺纬蓮?fù)合物后需要由腎排出，有可能會(huì)加重腎損傷[8]。事實(shí)上，除了DU促排外，阻斷DU在生物體內(nèi)的作用途徑，減輕DU對(duì)組織細(xì)胞的損傷，也是一種重要的救治方法。饑餓素是生長(zhǎng)激素分泌受體-1a(GHSR-1a)的內(nèi)源性配體，參與機(jī)體重要的生物學(xué)功能，例如能量代謝、抗炎癥、抗氧化及細(xì)胞的增殖和凋亡等[3]。本研究從細(xì)胞存活率骨代謝、OPG/RANKL系統(tǒng)調(diào)節(jié)及氧化應(yīng)激等幾方面初步證實(shí)，饑餓素對(duì)貧鈾所致MC3T3-E1細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。

本研究通過細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DU對(duì)細(xì)胞具有明顯的毒性作用，而饑餓素有效地提高了DU暴露后MC3T3-E1細(xì)胞的存活率，并且存活率隨饑餓素濃度增大而升高。提示饑餓素對(duì)DU暴露后的MC3T3-E1細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，且保護(hù)作用與饑餓素的濃度呈正相關(guān)。

本研究還觀察了饑餓素對(duì)骨代謝的影響，著重討論饑餓素對(duì)StrACP和AKP的影響情況。StrACP是酸性磷酸酶(ACP)同功酶的第5型，是公認(rèn)的鑒別破骨細(xì)胞的標(biāo)志之一，主要存在于破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中。骨吸收時(shí)，StrACP參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物的降解。因此，StrACP標(biāo)志著破骨細(xì)胞的活性，并在一定程度上反映了骨吸收狀況[9]。DU暴露后細(xì)胞StrACP水平明顯升高，饑餓素有效降低了DU暴露后StrACP的濃度，且StrACP的濃度與饑餓素的濃度呈負(fù)相關(guān)，提示饑餓素對(duì)破骨細(xì)胞的活性具有一定的抑制作用，進(jìn)而一定程度抑制骨吸收。AKP是成骨細(xì)胞分化時(shí)所分泌的酶，它的主要功能是在堿性條件下(pH7.6～9.9)水解多種磷酸酯并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用。AKP被普遍認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化和功能的標(biāo)志，能夠反映成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原、形成骨基質(zhì)的能力，其活性的高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀況[10]。DU暴露后細(xì)胞AKP水平明顯升高，饑餓素有效降低了DU暴露后AKP的濃度，且AKP的濃度與饑餓素的濃度呈負(fù)相關(guān)，提示饑餓素提高成骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而促進(jìn)骨生成。饑餓素抑制破骨細(xì)胞活性同時(shí)提高成骨細(xì)胞活性，使得骨吸收減少而骨生成增加，對(duì)骨代謝產(chǎn)生明顯影響。

a:Control；b：DU；c:DU+G1;d:DU+G10;e:DU+G100

本研究評(píng)價(jià)了饑餓素對(duì)骨代謝OPG/RANKL系統(tǒng)的影響。OPG/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路[11]，在骨形成和吸收的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用：成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)sRANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和激活；成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞則分泌OPG與sRANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止sRANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞活性[12]。饑餓素有效降低DU暴露后細(xì)胞sRANKL的濃度，使得破骨細(xì)胞分化和激活受到抑制；同時(shí)升高OPG的濃度，抑制破骨細(xì)胞活性，總體上使得sRANKL/OPG顯著降低，從而抑制破骨細(xì)胞活性，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，減少骨吸收增加骨生成。

本研究探究了饑餓素對(duì)DU中毒后細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。氧化應(yīng)激對(duì)成骨細(xì)胞的作用表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、阻礙細(xì)胞分化成熟、抑制成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)及骨基質(zhì)的礦化，導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性下降甚至死亡[13]。其中，CAT不但能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基(·OH),還能使之分解為H2O和O2,從而降低活性氧自由基的含量,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[14]。DU暴露后細(xì)胞CAT水平明顯升高，饑餓素有效提升DU暴露后細(xì)胞CAT水平，使得H2O2迅速分解為H2O和O2，有效降低細(xì)胞內(nèi)羥自由基水平，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。最終，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞ROS變化情況：正常情況下細(xì)胞ROS水平低，不易觀察，DU暴露后細(xì)胞ROS顯著上升，熒光顯微鏡視野下清楚觀察到ROS情況，饑餓素有效降低DU暴露后細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并且隨著饑餓素濃度升高ROS水平不斷降低。饑餓素顯著降低DU中毒后細(xì)胞氧化應(yīng)激，使細(xì)胞減少氧化損傷。

綜上所述，饑餓素有效提高DU暴露后MC3T3-E1細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞ROS水平減緩細(xì)胞氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)OPG/RANKL系統(tǒng)及骨代謝，降低骨損傷，起到顯著保護(hù)作用。

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(編輯：左艷芳)

Protective role of ghrelin in depleted uranium-induced damage of MC3T3-E1 cells

HAO Yu-hui,HUANG Jia-wei,LIU Cong,LI Rong

(Institute of Combined Injury,College of Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the impact of ghrelin on depleted uranium (DU)-induced damage of the osteoblast MC3T3-E1. MethodsMC3T3-E1 cells were treated with different doses of ghrelin for 1 h before DU (500 μM) treatment. After 24 hours,the cell viability,intracellular tartrate-resistant acid phosphatase (StrACP),alkaline phosphatase (AKP),osteoprotegerin (OPG),solvable receptor activator of nuclear factor-κB ligand (sRANKL),catalase (CAT) and reactive oxygen species (ROS) were measured. ResultsAfter DU exposure,ghrelin pretreatment increased the cell viability and CAT levels,and reduced intracellular StrACP,AKP,sRANKL/OPG and ROS in a dose-dependent manner. ConclusionThrough maintaining the balance of OPG/RANKL and reducing the oxidative stress,ghrelin could protect against DU-induced damage of MC3T3-E1 cells.

Keywords:ghrelin;depleted uranium;osteoblast;reactive oxygen species

[中圖分類號(hào)]R827.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)06-0595-04

[收稿日期]2015-03-05[修回日期] 2015-06-15

[基金項(xiàng)目]“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAK03B05-02)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81472913)；國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(SKLZZ201503)

doi:10.11659/jjssx.03E015064