于立明，趙國(guó)龍，金振曉，張秋芳，王曉武，高文麗，王 云，段維勛，俞世強(qiáng)

小檗堿減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷及其對(duì)Notch1／Hes1信號(hào)通路的調(diào)控研究

于立明，趙國(guó)龍，金振曉，張秋芳，王曉武，高文麗，王 云，段維勛，俞世強(qiáng)

［摘要］：目的 研究小檗堿（BBR）減輕大鼠心肌缺血再灌注（MI／R）損傷的作用及其對(duì)心肌Notch1／Hes1信號(hào)的調(diào)控。方法 100只雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組（Sham）、MI／R＋溶劑組（MI／R＋V）、MI／R＋BBR治療組（MI／R＋BBR）、Sham＋溶劑組（Sham＋V）、Sham＋BBR組。行結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支手術(shù)造成MI／R模型，心肌缺血30 min，再灌注4 h后檢測(cè)心肌Notch1受體胞內(nèi)區(qū)（NICD）及Hes1、PTEN、p－Akt／Akt比值和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，再灌注6 h后檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率、梗死面積及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，再灌注72 h后檢測(cè)心功能。結(jié)果 缺血再灌注損傷顯著下調(diào)左心射血分?jǐn)?shù)與左心室短軸縮短率，增加心肌凋亡率、梗死面積、血清乳酸脫氫酶及肌酸肌酶水平，而B(niǎo)BR治療可顯著改善心功能并減輕心肌凋亡及梗死。另外，BBR治療可顯著激活心肌Notch1／Hes1信號(hào)通路并調(diào)控PTEN／Akt信號(hào)，從而下調(diào)心肌凋亡信號(hào)（均P＜0．01）。結(jié)論BBR治療可顯著減輕MI／R損傷后心肌梗死及凋亡水平，改善心功能。同時(shí)，BBR治療可顯著上調(diào)缺血打擊后心肌Notch1／Hes1信號(hào)并對(duì)PTEN／Akt信號(hào)發(fā)揮調(diào)控作用，下調(diào)心肌凋亡信號(hào)。

［關(guān)鍵詞］：小檗堿；心肌缺血／再灌注損傷；Notch1信號(hào)；凋亡；心肌保護(hù)

作者單位：710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟外科［于立明（研究生）、金振曉、王曉武、段維勛、俞世強(qiáng)］；750004銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心臟外科［趙國(guó)龍、高文麗（研究生）、王云］；710004西安，第四醫(yī)院影像科（張秋芳）

Berberine protects the heart against myocardial ischemia reperfusion injury：role of Notch1／Hes1 signaling pathway

Yu Li－ming，Zhao Guo－long，Jin Zhen－xiao，Zhang Qiu－fang，Wang Xiao－wu，Gao Wen－li，Wang Yun，Duan Wei－xun，Yu Shi－qiang
Fourth Military Medical University，Xi＇an，710032，Shaanxi，China

Corresponding author：Yu Shi－qiang，Email：shiqiangyu210＠126．com

［Abstract］：Objective To explore the ameliorative effect of berberine（BBR）on myocard ial ischemia／reperfusion（MI／R）in?jury in rats and its influence on myocardial Notch1／Hes1 signaling pathway．Methods 100 male Sprague－Dawley rats were randomly assigned to 5 groups：Sham，MI／R＋V（vehicle），MI／R＋BBR，Sham＋V and Sham＋BBR，and then exposed to myocardial ischemia／reperfusion（MI／R）surgery．After 4 h of reperfusion，myocardial NICD（Notch1 intracellular domain），Hes1，PTEN，p－Akt／Akt ra?tio and apoptotic related protein espressions were measured．After 6 h of reperfusion，myocardial apoptotic index and infarct size were e?valuated．The cardiac function were measured 72 h after reperfusion．Results BBR treatment significantly improved the cardiac func?tional recovery and reduced myocardial apoptosis．Additionally，BBR treatment also modulated PTEN／Akt signaling by activating Notch1／Hes1 signaling．Conclusion This study showed that BBR protected the heart against MI／R injury by reducing apoptosis possi?bly through Notch1／Hes1 signaling pathway．

［Key words］： Berberine；Myocardial ischemia／reperfusion injury；Notch1 signaling；apoptosis；Cardioprotection

缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，及時(shí)恢復(fù)缺血心肌血流灌注是其首要治療策略，但是缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞，恢復(fù)血液供應(yīng)后轉(zhuǎn)化為不可逆損傷，誘發(fā)心肌缺血／再灌注（myocardial ische?mia／reperfusion injury，MI／R）損傷［1－2］。小檗堿（berberine，BBR）是從毛茛科植物黃連（Coptis chinensi）根莖中提取的有效成分，有抗心律失常、抗充血性心力衰竭、降血糖血脂等保護(hù)作用［3］。近年來(lái)有研究指出小檗堿對(duì)心肌缺血性疾病有較好的保護(hù)作用［4］，但其具體機(jī)制尚不明確。Notch信號(hào)通路是一個(gè)進(jìn)化上保守的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路，其廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化以及器官的發(fā)育等過(guò)程，Notch信號(hào)通路的活化參與了多種氧化應(yīng)激和炎癥病理過(guò)程［5］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch1信號(hào)發(fā)揮心肌保護(hù)作用［6－7］，然而Notch信號(hào)通路是否參與BBR的心肌保護(hù)作用尚未有報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)采用大鼠MI／R模型，探討小檗堿對(duì)MI／R損傷的保護(hù)作用及其對(duì)心肌Notch1／Hes1信號(hào)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1．1 材料 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠100只，質(zhì)量約180～220 g，普食喂養(yǎng)，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。BBR（Sigma公司），羧甲基纖維素鈉（CMC －Na，solarbio公司），原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)試劑盒（Roche公司），氯化三苯氮四唑（TTC）檢測(cè)試劑（Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）及肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物公司），NICD抗體（Abcam公司），Hes1、PTEN、Caspase－3、Bcl－2、Bax、cleaved Caspase－3、磷酸化Akt（p－Akt，Ser 473）抗體、Akt抗體（Santa Cruz公司）。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物的分組 100只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組（每組20只）：①假手術(shù)組（Sham組）：術(shù)中不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；②MI／R＋溶劑組（MI／R＋V組）：MI／R手術(shù)前，5 g／L CMC－Na溶液給予大鼠灌胃處理1．5 ml／d，2 w；③MI／R＋BBR組：MI／R手術(shù)前，BBR 200 mg／kg給予大鼠灌胃處理1．5 ml／d，2 w，BBR溶解于5 g／L CMC－Na溶液制成懸濁液；④Sham＋V組：大鼠給予同上5 g／L CMC－Na溶劑處理2 w后行假手術(shù)不結(jié)扎冠脈；⑤Sham＋BBR組：大鼠給予同上BBR處理2 w后行MI／R手術(shù)。心肌缺血再灌注手術(shù)按文獻(xiàn)［4］的方法于胸骨左緣2 ～4肋間打開(kāi)胸腔及心包膜，暴露心臟；在肺動(dòng)脈圓錐右緣、平左心耳下緣0．5～1 cm處，用6－0絲線圍繞前降支打一活結(jié)，線結(jié)內(nèi)墊一粗橡膠管，通過(guò)拉緊和松開(kāi)活結(jié)模擬心臟缺血和再灌注過(guò)程。

1．2．2 心功能檢測(cè) MI／R手術(shù)后72 h，利用Ve?vo770小動(dòng)物超聲儀（VisualSonics，Toronto，Cana?da）檢測(cè)并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）等心功能的變化，測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值作為檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1．2．3 心肌梗死范圍的測(cè)定 再灌注結(jié)束后，再次結(jié)扎冠脈，向左心室腔注入10 g／L伊文氏藍(lán)（1～2 ml）。迅速取出心臟，凍存于－20℃。用心臟切片器垂直于心臟長(zhǎng)軸將其切成1 mm厚的薄片，置于20 g／L TTC（pH 7．4）的6孔培養(yǎng)皿中，于37℃孵育15 min。用數(shù)碼相機(jī)拍照并輸入計(jì)算機(jī)。采用單盲法分別將伊文氏藍(lán)染色區(qū)（非缺血區(qū)）、TTC染色區(qū)（紅染，缺血區(qū)但組織仍存活）及非TTC染色區(qū)（MI區(qū)），用Sigma Scan面積測(cè)算，Image Pro plus軟件進(jìn)行計(jì)算處理。梗死范圍以每一心臟總梗死面積（INF）占總?cè)毖獏^(qū)面積（AAR）的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1．2．4 心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測(cè) 按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。MI／R 6 h后，立即取出心臟，以預(yù)冷的PBS沖洗干凈，取心尖部約2～5 mm組織。將取下組織切去心臟冠狀面最大橫徑，置于40 g／L甲醇溶液中固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋切片。每張切片在凋亡區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)以上高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野內(nèi)凋亡細(xì)胞核數(shù)，總細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率（apoptotic index）。

1．2．5 Notch1等蛋白表達(dá)的檢測(cè) 再灌注過(guò)程結(jié)束后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，剪取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，液氮中速凍，置－80℃冰箱中保存待測(cè)。取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，勻漿、離心后，取上清液分裝保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，50 mol／L脫脂牛奶封閉，分別加NICD抗體（Abcam公司，1∶1 000），Hes1、PTEN、Caspase－3、Bcl－2、Bax、cleaved Caspase －3、p－Akt抗體、Akt抗體，稀釋比均為1∶500，4℃過(guò)夜，TBST洗脫3次，分別加1∶5 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，使用ECL－plus試劑盒發(fā)光，通過(guò)生化檢測(cè)系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，以β－actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用Prism 5．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），若總體差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。以P＜0．05為差異顯著的界限。

2 結(jié) 果

2．1 各組心功能的比較 大鼠心肌缺血再灌注72 h后超聲心動(dòng)圖顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋BBR組LVEF與LVFS顯著提高（均P＜0．05，圖1），而單純?nèi)軇?duì)照組與BBR組對(duì)心臟功能無(wú)顯著影響（均P＞0．05，圖1）。

圖1　各組心功能的比較

圖2　各組心肌細(xì)胞凋亡率及INF的比較

2．2 各組心肌細(xì)胞凋亡率及INF的比較 大鼠心肌缺血再灌注6 h后留取心肌組織TUNEL凋亡檢測(cè)顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋BBR組心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降（均P＜0．01，圖2A）；再灌注6 h后取心臟進(jìn)行Evans blue－TTC雙染切片統(tǒng)計(jì)顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋BBR組INF顯著下降（均P＜0．01，圖2B），檢測(cè)血清LDH與CK指標(biāo)顯示與MI／R＋V組相比，MI／R＋BBR組血清LDH與CK水平顯著下降（均P＜0．01，圖2C，D），Sham組與BBR組對(duì)心肌凋亡及梗死無(wú)顯著影響（均P＞0．05，圖2）。

2．3 各組Notch1通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 大鼠MI／R 4 h后，留取心肌組織，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組相比，MI／R＋V組心肌NICD、Hes1、PTEN表達(dá)無(wú)顯著差異（均P＞0．05，圖3B、C及D）。與Sham組相比，MI／R＋V組心肌p －Akt／Akt比值、Caspase－3、Bax及cleaved Caspase－3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl－2表達(dá)顯著下調(diào)（均P＜0．05，圖3E－I）。BBR治療組顯著上調(diào)NICD、Hes1、p－Akt／Akt比值及Bcl－2表達(dá)，下調(diào)PTEN、Caspase－3、Bax及cleaved Caspase－3表達(dá)（與MI／R＋V組相比，均P＜0．05，圖3）。

圖3　各組Notch1通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

急性冠狀動(dòng)脈疾病在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為心血管發(fā)病與致死的主要原因。臨床上部分患者接受治療，在恢復(fù)血流再灌注后，早期缺血心肌損傷加重，引起更多心肌細(xì)胞死亡，心肌梗死面積變大，從而進(jìn)一步損害心功能，被稱(chēng)為MI／R損傷［8－9］。有研究指出，心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡在MI／R損傷的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如何減輕再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡并維護(hù)心功能一直是基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

BBR是從黃連或黃柏皮中提煉出來(lái)的一種異喹啉生物堿，早期多用于治療腸道細(xì)菌感染性疾?。?］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，BBR具有降血糖、抗腫瘤、抗血小板聚集等作用［4］。最新的研究表明，BBR可以減輕MI／R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［4，10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注手術(shù)前給予大鼠BBR口服治療2 w可顯著減輕MI／R損傷，減輕心肌細(xì)胞凋亡，改善術(shù)后心功能。

20世紀(jì)80年代，Artavanis Tsakonas研究組首次克隆了Notch基因。迄今為止，在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4類(lèi)Notch基因，編碼4種Notch受體，分別為Notch 1～4［11］。Notch是一種跨膜二聚體受體，在生理?xiàng)l件下，Notch配體通過(guò)與受體的結(jié)合，啟動(dòng)Notch信號(hào)途徑，利用α分泌酶和γ分泌酶進(jìn)行一系列溶蛋白性裂解反應(yīng)，釋放Notch1受體胞內(nèi)區(qū)（NICD）。NICD進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)連接普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子、CBF1等調(diào)控Hes1基因的表達(dá)［5］。研究證明，Notch信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育及病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。近年來(lái)，Notch1受體和其下游信號(hào)分子Hes1在缺血性心臟病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。周等［12］發(fā)現(xiàn)MI／R過(guò)程中激活Notch1分子可通過(guò)激動(dòng)下游Hes1分子發(fā)揮抑制PTEN表達(dá)的作用，從而減輕MI／R損傷，而裴等［13］證實(shí)，激活心肌Notch1信號(hào)通路可通過(guò)下游Hes1信號(hào)減輕由MI／R損傷引起的氧化應(yīng)激與硝化應(yīng)激損傷從而保護(hù)缺血心肌。PI3K／Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、遷移等過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用，作為心肌缺血過(guò)程中的“生存信號(hào)”，該信號(hào)激活已被證實(shí)發(fā)揮重要的抗凋亡作用［14］，其不僅在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮上下游調(diào)控作用，信號(hào)系統(tǒng)的激活也在多種腫瘤細(xì)胞系中發(fā)揮重要的促腫瘤生長(zhǎng)作用［16－17］。迄今為止，尚無(wú)研究報(bào)道Notch1／Hes1－PTEN／Akt信號(hào)系統(tǒng)在BBR的心肌保護(hù)中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)BBR在保護(hù)缺血心肌的同時(shí)，激活Notch1／Hes1表達(dá)，從而抑制PTEN的表達(dá)進(jìn)而增加Akt磷酸化，從而發(fā)揮抗凋亡作用，雖然仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確證Notch1／Hes1信號(hào)與PTEN／Akt信號(hào)在此過(guò)程中的上下游關(guān)系，本研究仍強(qiáng)烈提示BBR的心肌保護(hù)作用可能與Notch1／Hes1及PTEN／Akt信號(hào)密切相關(guān)。

總之，筆者證實(shí)：BBR治療顯著減輕MI／R后心肌凋亡與壞死，提高心功能，而B(niǎo)BR的心肌保護(hù)作用很可能與其激活Notch1／Hes1信號(hào)并調(diào)控PTEN／Akt通路從而減輕MI／R心肌損傷相關(guān)。本研究揭示了BBR保護(hù)缺血心肌新機(jī)制，并為BBR相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］熊紅燕，楊陽(yáng)，李珊，等．缺血預(yù)處理對(duì)糖尿病心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2012：9 （3）：185－188．

［2］趙國(guó)龍，張秋芳，翟蒙恩，等．褪黑素受體對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的調(diào)控及其機(jī)制研究［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2015：13（2）：113－118．

［3］Kumar A，Ekavali，Chopra K，et al．Current knowledge and pharmacological profile of berberine：An update［J］．Eur J Phar?macol，2015，761：288－297．

［4］Yu L，Li F，Zhao G，et al．Protective effect of berberine against myocardial ischemia reperfusion injury：role of Notch1／Hes1－PTEN／Akt signaling［J］．Apoptosis，2015，20（6）：796－810．

［5］Ferrari R，Rizzo P．The Notch pathway：a novel target for myocar?dial remodelling therapy［J］？Eur Heart J，2014，35（32）：2140 －2145．

［6］楊陽(yáng)，段維勛，王寧，等．γ－分泌酶抑制劑對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2013，11 （1）：41－44．

［7］楊陽(yáng)，段維勛，周京軍，等．γ－分泌酶抑制劑對(duì)正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2011，9（2）：89－92．

［8］楊陽(yáng)，段維勛，梁振興，等．Jagged1蛋白對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2012，10（4）：235－238．

［9］楊陽(yáng)，金振曉，段維勛，等．缺血再灌注前后人心肌組織中Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的變化［J］．中國(guó)體外循環(huán)雜志，2010，8（4）：236－238．

［10］Huang Z，Han Z，Ye B，et al．Berberine alleviates cardiac ische?mia／reperfusion injury by inhibiting excessive autophagy in car?diomyocytes［J］．Eur J Pharmacol，2015，762：1－10．

［11］Li Y，Hiroi Y，Liao JK．Notch signaling as an important mediator of cardiac repair and regeneration after myocardial infarction［J］．Trends Cardiovasc Med，2010，20（7）：228－231．

［12］Zhou XL，Wan L，Liu JC．Activated Notch1 reduces myocardial ischemia reperfusion injury in vitro during ischemic postcondition?ing by crosstalk with the RISK signaling pathway［J］．Chin Med J （Engl），2013，126（23）：4545－4551．

［13］Pei H，Yu Q，Xue Q，et al．Notch1 cardioprotection in myocar?dial ischemia／reperfusion involves reduction of oxidative／nitrative stress［J］．Basic Res Cardiol，2013，108（5）：373．

［14］Yu Q，Gao F，Ma XL．Insulin says NO to cardiovascular disease ［J］．Cardiovasc Res，2011，89（3）：516－524．

［15］Wang LQ，Liu JC，Chen CL，et al．Regulation of primordial fol?licle recruitment by cross－talk between the Notch and phosphatase and tensin homologue（PTEN）／AKT pathways［J］．Reprod Fertil Dev，2014．

［16］El Hindy N，Keyvani K，Pagenstecher A，et al．Implications of Dll4－Notch signaling activation in primary glioblastoma multi?forme［J］．Neuro Oncol，2013，15（10）：1366－1378．

［17］Liu S，Ma X，Ai Q，et al．NOTCH1 functions as an oncogene by regulating the PTEN／PI3K／AKT pathway in clear cell renal cell carcinoma［J］．Urol Oncol，2013，31（6）：938－948．

·綜 述·

修訂日期：（2015?08?07）

收稿日期：（2015?07?09）

通訊作者：俞世強(qiáng)，Email：shiqiangyu210＠126．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81470415，81270170，81200151，81470411）；國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI11B20）；陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目（2015KW－047）；陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃（2015SF104，2012K15－02－01）；西京醫(yī)院學(xué)科助推計(jì)劃（XJZT14203，XJGX12C11，XJGX13LC15）