劉 洪，孫 雯，鄭陽玉

（1．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)技術(shù)教研室，江蘇鹽城224005；2．南京醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)系 210029；3．南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所 210029）

常染色體顯性遺傳低磷性佝僂?。╝utosomal－dominant hypophosphatemic rickets，ADHR）［1］是一種常見的佝僂病。導(dǎo)致ADHR的主要原因在于FGF－23（R176Q）錯(cuò)義突變后無法被蛋白水解酶水解，導(dǎo)致FGF－23在體內(nèi)蓄積，腎臟磷酸鹽回收不足導(dǎo)致磷酸鹽尿，腎臟1－羥化酶（1－alpha－h(huán)ydroxylase，1－ase）的合成被抑制，1，25（OH）2D3合成減少［2］。利用轉(zhuǎn)基因的手段將錯(cuò)義突變的人FGF－23基因轉(zhuǎn)入小鼠，構(gòu)建ADHR的小鼠動(dòng)物模型FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠。表型分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出發(fā)育緩慢、肌張力降低、手足搐搦、囟門閉合不全等佝僂病的癥狀，與ADHR患者的癥狀基本一致［3］。但是，F(xiàn)GF－23（R176Q）過表達(dá)對(duì)下頜骨的形成、礦化是否有影響，目前，未見有相關(guān)報(bào)道。本研究利用8周齡的FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩的野生型小鼠，通過X線掃描、組織學(xué)等手段進(jìn)行觀察，試圖闡明FGF－23（R176Q）對(duì)小鼠下頜骨形成和礦化是否有影響以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用同窩的8周齡野生型（wild type，WT）小鼠和FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠各15只，雌雄不限，飼養(yǎng)于無特殊病原體級(jí)動(dòng)物房，使用常規(guī)飲食（1．0%鈣，0．5%磷）進(jìn)行飼養(yǎng)。

1．2 動(dòng)物基因型鑒定及分組 剪取1mm長鼠尾，使用酚－氯仿－異戊醇法進(jìn)行DNA的提取，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行小鼠基因型的鑒定。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行觀察。根據(jù)基因型的結(jié)果分為TG組和WT組，PCR電泳結(jié)果有436bp條帶者為FGF－23（R176Q）小鼠，無條帶者為 WT小鼠［4］。

1．3 血清學(xué)檢查 小鼠使用乙醚進(jìn)行麻醉，麻醉后固定于動(dòng)物臺(tái)上，使用1mL注射器進(jìn)行心臟采血，4℃下以2 000 r／min離心10min，抽取上層血清，使用放射免疫法進(jìn)行血清鈣、磷和1，25（OH）2D3濃度檢測。

1．4 取材 解剖分離小鼠的左側(cè)下頜骨并免疫電鏡固定液固定，采用乙二胺四乙酸（EDTA）法脫鈣2周，脫水包埋，按照下頜第1磨牙近中根根管方向?qū)ο骂M骨進(jìn)行橫斷面切片，切片厚度5μm。解剖分離小鼠的左側(cè)下頜骨，使用75%乙醇固定，進(jìn)行CT檢查。

1．5 CT檢查 使用SkyScan 1072scanner掃描儀對(duì)75%乙醇固定的小鼠下頜骨進(jìn)行掃描檢查，掃描電壓100kV，電流98 mA，通過CT檢查觀察兩組小鼠的下頜骨骨密度變化情況。

1．6 染色觀察

1．6．1 總膠原染色 石蠟切片脫蠟水化，用配制好的苦味酸直紅染色液孵育1h，流水沖洗5min，蘇木精染色10min，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．6．2 二聚糖免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片使常規(guī)脫蠟水化，用5%正常兔血清封閉20min，分別加入羊抗鼠二聚糖一抗（1∶500，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜，PBST清洗，加兔抗羊IgG二抗（1∶200，美國Sigma公司），室溫孵育30 min；PBST清洗，加Elite－ABC（英國Vector公司）孵育30min，PBS清洗，加DAB溶液（英國Vector公司）室溫避光孵育5～8 min，蘇木精復(fù)染1min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察攝片，計(jì)算聚糖在下頜骨中的陽性面積比例。

1．6．3 HE染色 石蠟切片使常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色10 min，流水沖洗后使用伊紅染色30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下測量2種不同基因型小鼠下頜骨成骨細(xì)胞密度（Ob．s／B．Pm）。

1．7 骨鈣素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測 解剖小鼠的下頜磨牙，一步法提取總RNA，常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用real time RT－PCR方法檢測下頜骨的OCN和Ⅰ型膠原（typeⅠcollagen）基因的表達(dá)水平。OCN正向引物序列為：5′－CAA GTC CCA CAC AGC AGC TT－3′，反向引物序列為：5′－AAA GCC GAG CTG CCA GAG TT－3′，產(chǎn) 物 370 bp，Ⅰ型膠原正向引物序列為：5′－TCT CCA CTC TTC TAG TTC CT－3′，反向引物序列為：5′－TTG GGT CAT TTC CAC ATG C－3′，產(chǎn)物269bp，使用 Applied biosystems 7300型實(shí)時(shí)定量RT－PCR儀擴(kuò)增并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以WT組的表達(dá)量作為參照。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血清學(xué)指標(biāo)檢查 WT組小鼠血清鈣、磷和1，25（OH）2D3濃度均明顯高于TG組，而WT組的PTH的濃度低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1。

表1 兩組小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢查（x±s）

2．2 CT檢查結(jié)果 CT的檢查結(jié)果顯示，而TG組頜骨X線阻射程度低于WT組小鼠，并且TG組下頜第1磨牙有齲壞發(fā)生（圖1）。

圖1 2種小鼠CT掃描

2．3 總膠原染色結(jié)果 WT組下頜骨相對(duì)骨量為（68．56±19．65）%；TG組下頜骨相對(duì)骨量為（38．14±14．29）%，TG組的下頜骨相對(duì)骨量低于 WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．85，P＜0．05），見圖2。

圖2 2種小鼠總膠原染色結(jié)果（×200）

2．4 HE染色結(jié)果 通過對(duì)HE染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT組成骨細(xì)胞密度（26．24±7．56）／mm，而 TG組為（14．68±6．89）／mm，WT組成骨細(xì)胞密度高于 TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．38，P＜0．05），見圖3。

圖3 2種小鼠HE染色結(jié)果（×400）

2．5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 通過對(duì)TG組和WT組的DSP和聚糖免疫組織化學(xué)陽性百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT

組的聚糖陽性百分比為（6．52±1．28）%，TG 組為（12．68±2．54）%，TG組高于 WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8．39，P＜0．05），見圖4。

圖4 2種小鼠聚糖免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

2．6 ALP和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測 通過使用RTPCR檢測TG組和WT組OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT組的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平均明顯高于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

表2 兩組小鼠OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)TG組小鼠的血清鈣、磷和1，25（OH）2D3的濃度均低于WT組小鼠，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。其原因在于體內(nèi)過高濃度突變的FGF－23抑制1羥化酶的活性，導(dǎo)致1，25（OH）2D3的合成減少，同時(shí)減少腎臟、小腸對(duì)鈣和磷的重吸收，從而導(dǎo)致了血清鈣、磷濃度降低［5］。

CT掃描結(jié)果表明，TG組小鼠的下頜骨X線透光率明顯高于WT組小鼠，表明TG小鼠下頜骨存在礦化障礙，這個(gè)研究結(jié)果與對(duì)1－羥化酶敲除小鼠研究結(jié)果基本一致［6］。同時(shí)，總膠原染色結(jié)果顯示TG組小鼠的下頜骨骨量明顯低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。同時(shí)，HE染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TG組的單位長度上的成骨細(xì)胞數(shù)目也明顯少于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)GF－23（R176Q）過表達(dá)導(dǎo)致了成骨細(xì)胞減少，進(jìn)而影響了下頜骨的骨基質(zhì)的形成和礦化。此外，二聚糖的免疫組織化學(xué)結(jié)果也提示FGF－23（R176Q）過表達(dá)導(dǎo)致了二聚糖在下頜骨中的表達(dá)增加。聚糖僅在未礦化的組織中如前期牙本質(zhì)、未礦化類骨質(zhì)表達(dá)［7］，礦化完成后二聚糖即被分解，而高濃度的二聚糖能夠抑制礦化過程的持續(xù)進(jìn)行［8］。本研究同樣表明，當(dāng) FGF－23（R176Q）過表達(dá)時(shí)，二聚糖在下頜骨骨基質(zhì)的蛋白沉積水平增加，表明其下頜骨骨基質(zhì)中未礦化的基質(zhì)比例明顯增加，由此導(dǎo)致了下頜骨礦化障礙。

此外，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠下頜骨的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平均明顯低于 WT小鼠，表明FGF－23（R176Q）過表達(dá)抑制了下頜骨成骨細(xì)胞的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)。研究表明，OCN能夠促進(jìn)羥基磷灰石晶體的形成和沉積［9］，能促進(jìn)牙齒和骨骼的礦化［10－11］，而Ⅰ型膠原是骨骼的主要胞外基質(zhì)，在骨質(zhì)的形成中起到無機(jī)質(zhì)礦化的框架作用［12］。作者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）在體內(nèi)過表達(dá)一方面導(dǎo)致抑制了下頜骨成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原的合成，導(dǎo)致了下頜骨的胞外基質(zhì)分泌減少，另外一方面導(dǎo)致了下頜骨成骨細(xì)胞OCN合成減少，導(dǎo)致了下頜骨礦化出現(xiàn)異常。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠下頜骨出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松、礦化不良等表型，與作者以前研究的1－羥化酶基因敲除小鼠的下頜骨的表型［13－15］較為相似，其主要原因在于FGF－23（R176Q）過表達(dá)抑制了1，25（OH）2D3的合成，同時(shí)還導(dǎo)致了低鈣、低磷血癥，并且還導(dǎo)致下頜成骨細(xì)胞密度下降，減少了OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平，阻礙了下頜骨胞外基質(zhì)的合成與分泌和礦化過程的進(jìn)行，最終阻礙了下頜骨的正常發(fā)育和礦化。

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