伍玉燕等

[摘要] 目的 分析東莞地區(qū)不育男性患者精子功能相關(guān)檢查結(jié)果。 方法 隨機(jī)選取本院25～44歲300例診斷為男性不育患者（不育組）與200名正常生育男性（對(duì)照組）精液標(biāo)本，比較兩組精子形態(tài)學(xué)分析、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測(cè)及進(jìn)行去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)的受精指數(shù)的差異，并將各項(xiàng)指標(biāo)與不育進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果 不育組精子正常形態(tài)百分率（3.00±2.30）%，對(duì)照組精子正常形態(tài)百分率（8.00±4.30）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不育組精子頂體酶活性為（69.40±31.50）?IU/106精子，對(duì)照組精子頂體酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），不育組DNA碎片率（20.94±1.00）%，對(duì)照組DNA碎片率（11.27±0.79）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不育組與對(duì)照組中去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)受精指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各種檢查結(jié)果與不育的相關(guān)回歸分析結(jié)果是，精子正常形態(tài)率與不以呈負(fù)相關(guān)（r=-0.823，P<0.05）、頂體酶活性與不育呈負(fù)相關(guān)（r= -0.723，P<0.05），與不育呈正相關(guān)的有頭部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。 結(jié)論 精子形態(tài)分析、頂體酶活性、精子DNA碎片檢測(cè)是檢測(cè)精子功能的有效指標(biāo)。精子正常形態(tài)率、頂體酶活性與不育呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與不育正相關(guān)的有頭部畸形率、DNA碎片率。

[關(guān)鍵詞] 不育；精子形態(tài)；DNA碎片檢測(cè)；去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)；頂體酶活性

[中圖分類號(hào)] R698.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）24-18-04

The value of sperm function parameters analysis for male infertility in Dongguan city

WU Yuyan CHEN Limei WANG Bin LIU Zhigang CHEN Huinan

Department of Reproductive Medicine，Dongguan People's Hospital of Guangdong Province，Dongguan 523000，China

[Abstract] Objective To study the sperm function parameters of male infertility in Dongguan city. Methods According to the difference of the reproductive function，semen samples randomly selected and divide to two groups（25-44 years old）：300 cases of male infertility（infertility group） and 200 normal fertile men（control group）.Compare of two groups the sperm morphology index，acrosomal enzyme index，sperm DNA fragmentation index and fertility index in Zona free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）.And study the parameters correlation to infertility. Results The difference of the normal sperm morphology rate was significant（P<0.05）with the infertility group（3.00±2.30）% vs the control group（8.00±4.30）%.The acrosomal enzyme index in infertility group was（69.40±31.50）?IU/106 sperm，vs the control group（93.50±32.70）?IU/106sperm，the difference was statistically significant（P<0.05）.DNA fragmentation Index in infertility group was（20.94±1.00）% vs the control group（11.27±0.79）%，with statistical significance（P<0.05）.The fertilization index between two groups in SPA had no statistical difference（P>0.05）.The normal morphology rate（r=-0.823，P<0.05）and acrosomal enzyme（r=-0.723， P<0.05）are in negative correlation to infertility，and head deformity rate（r=0.894，P<0.05）and DNA fragmentation rate（r=0.778，P<0.05）are in positive correlation with infertility. Conclusion The index of sperm morphology，acrosomal enzyme，DNA fragmentation have high clinical application value for evaluating male semen quality.The normal sperm morphology rate and acrosomal enzyme are in negative correlation to infertility，while head deformity rate and DNA fragmentation rate are in positive correlation with infertility.endprint

[Key words] Infertility；Sperm morphology；DNA fragmentation index；Zona-free hamster oocyte human sperm penetration assay（SPA）；Acrosomal enzyme

男性不育癥，是指單純因?yàn)槟行砸蛩厮鶎?dǎo)致的正常性生活，未采取避孕措施一年未能使配偶懷孕。隨著男方因素導(dǎo)致的不育比例越來(lái)越多，早期

診斷病因?qū)χ委熌行圆挥Y尤其重要，以往對(duì)于臨床醫(yī)師來(lái)說(shuō)，男性不育的檢測(cè)指標(biāo)僅有精液常規(guī)分析，這些檢測(cè)項(xiàng)目固然為男性不育癥的診治提供了有價(jià)值的資料，可是未能反映精子全面的功能狀態(tài)，目前研究最多精子功能檢查為精子形態(tài)學(xué)檢查、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測(cè)及進(jìn)行去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)，但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)廣泛臨床應(yīng)用，基本是作為實(shí)驗(yàn)研究，其正常值范圍寬泛，且少有不育人群與正常人群的臨床對(duì)照?qǐng)?bào)道，因此嚴(yán)重影響到受精功能的評(píng)估。本研究通過(guò)對(duì)比東莞市不育男性與正常生育男性的精子功能相關(guān)檢查的結(jié)果：精子形態(tài)學(xué)檢查、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測(cè)及進(jìn)行去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)，分析其與不育的關(guān)系，旨在希望獲得甄選檢測(cè)精子生育能力比較可靠的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2013年9月～2014年6月生殖醫(yī)學(xué)科門診就診的25～44歲生育期的男性作為研究對(duì)象，平均年齡（32.0±4.8）歲，按照根據(jù)生育功能差異分為不育組300例，平均年齡（33±5.2）歲，對(duì)照組200例，平均年齡（31.0±4.9）歲，兩組的一般資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

不育組的入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)律性生活未避孕一年不孕，并排除女方因素（包括女方年齡>35歲、輸卵管因素、排卵問(wèn)題、宮頸因素等）的男性患者；（2）未服用過(guò)影響精子功能的藥物；（3）對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)是為1年內(nèi)令配偶正常受孕，自愿或有償愿意提供精液檢測(cè)的男性。

1.2 標(biāo)本采集

檢驗(yàn)者要求規(guī)范取精：禁欲2～7d，取精前先清潔雙手，本研究取精房?jī)?nèi)通過(guò)手淫法留取全部精液標(biāo)本于潔凈無(wú)菌的一次性采精杯中，不得以安全套或中斷性交方式留取精液，輕輕混勻，待其在37℃環(huán)境溫度下20～30min完全液化后進(jìn)行精子功能實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 精液形態(tài)學(xué)參數(shù)計(jì)算方法 采用拉薄技術(shù)，Diff-Quick法染色，精子形態(tài)類型標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）《人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）[1]，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析，分為頭部畸形、中部畸形、尾部畸形，將形態(tài)學(xué)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常精子。100倍油鏡下觀察200個(gè)精子形態(tài)并記錄，計(jì)算正常形態(tài)精子百分率。

1.3.2 采取改良Kennedy法檢測(cè)頂體酶活性值 采集新鮮精液完全液化后，根據(jù)精子密度計(jì)算標(biāo)本量，得到精子量約7.5×106個(gè)；標(biāo)本離心2000g×20min，棄去精漿，加入抑制劑100?L，反應(yīng)液100μL，混勻后于24℃孵育lh，倒入0.5cm比色皿，分光光度計(jì)波長(zhǎng)410nm下讀取數(shù)值，頂體酶活性=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）×106/247.5×7.5。

1.3.3 采取精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)（sperm chromatin dispersion test，SCD）檢測(cè)精子DNA碎片率 精液標(biāo)本洗滌后加入平衡后與瓊脂糖混勻，混合物滴于玻片上，冷卻后酸液洗去除核蛋白，酶解液消化后脫水干燥，使用DAPI進(jìn)行熒光染色，熒光顯微鏡觀察，去除核蛋白后，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，DNA環(huán)附著于殘留的核結(jié)構(gòu)，形成光暈。正常的精子DNA產(chǎn)生擴(kuò)散的光暈，而損傷的精子DNA則不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的光暈。記錄DNA完整率、碎片率。

1.3.4 去透明帶倉(cāng)鼠人精子穿透實(shí)驗(yàn)（SPA） 可用卵子受精率與受精指數(shù)作為評(píng)估參數(shù)，受精指數(shù)更常用。卵子受精率=受精卵子數(shù)/卵總數(shù)×100。受精指數(shù)（fertilization index，F(xiàn)I）：由于透明帶已去除，一個(gè)卵子可被多個(gè)精子穿透。FI為穿透卵子的精子總數(shù)與卵子總數(shù)之商，從整體上反映精子的穿透力與頂體反應(yīng)，可按下式計(jì)算：FI=穿入卵子的精子總數(shù)/卵子總數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較用t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Logistic回歸進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子形態(tài)參數(shù)比較

2.2 兩組精子頂體酶活性、DNA碎片率、FI參數(shù)比較

不育患者中，頂體酶活性為（69.40±11.50）?IU/106

精子，正常生育男性頂頂體酶活性為（93.50± 42.70）μIU/106精子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 不育與精子形態(tài)及精子功能指標(biāo)相關(guān)性回歸分析

精子正常形態(tài)率、頂體酶活性、卵子受精率、受精指數(shù)與不育呈正相關(guān)關(guān)系，與不育負(fù)相關(guān)的有頭部畸形率、STD、STI、DNA碎片率。

3 討論

在正常育齡夫婦中，不育癥的發(fā)病率約為10%～15%，其中單純因男方原因所致不育者可達(dá)40%以上。東莞市雖是一個(gè)地區(qū)市，但人口眾多，不孕不育夫婦隊(duì)伍龐大，使得男性不育的實(shí)驗(yàn)室檢查顯得尤為重要。既往男性不育的檢測(cè)指標(biāo)僅有精液常規(guī)分析以及內(nèi)分泌檢查，這些檢測(cè)項(xiàng)目固然為男性不育癥的診治提供了有價(jià)值的資料，可是未能反映精子全面生育能力。人精-卵融合通常在體內(nèi)（IVF-ET除外）才能發(fā)生，對(duì)于體內(nèi)受精過(guò)程來(lái)說(shuō)，精子首先須經(jīng)頂體反應(yīng)獲能后才能穿透卵子，其過(guò)程復(fù)雜。精-卵受精機(jī)制雖已基本闡述明白，但是臨床上目前這方面國(guó)內(nèi)外沒(méi)有通用評(píng)估檢測(cè)指標(biāo)，因此要全面研究精子的生育能力，需要進(jìn)行更進(jìn)一步相關(guān)功能檢查。目前研究最多的為精子形態(tài)學(xué)檢查、頂體酶活性、精子DNA碎片檢測(cè)及進(jìn)行去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)。endprint

一般認(rèn)為，正常形態(tài)精子率越低，精子頭部畸形率越高，男性的生育能力也就越差。本研究結(jié)果顯示對(duì)照組精子正常形態(tài)率為（8.00±4.30）%和不育組正常形態(tài)率（3.00±2.30）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，回歸分析表明，正常形態(tài)率與不育是負(fù)相關(guān)關(guān)系，頭部畸形率與不育是正相關(guān)關(guān)系。因此可知精子形態(tài)學(xué)檢查是評(píng)估精子手段的另一有效的補(bǔ)充，因操作方便，因此可廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)每一位不育夫婦，均應(yīng)將常規(guī)精液檢查與精子形態(tài)學(xué)檢查相互結(jié)合作為一線檢查手段。同時(shí)，我們觀察到無(wú)論對(duì)照組或不育組，正常精子形態(tài)率均較WHO第4版診斷標(biāo)準(zhǔn)低，因此第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)更實(shí)用于當(dāng)今男性精子功能評(píng)估，但也說(shuō)明東莞市男性精子出現(xiàn)普遍生育力下降的現(xiàn)象，可能與本地區(qū)工業(yè)水平高污染嚴(yán)重有關(guān)。

從20世紀(jì)70年代，人類已經(jīng)開始頂體酶與不育的研究，頂體酶是受精過(guò)程中重要的蛋白水解酶，通常以無(wú)活性頂體酶原形式存在于精子頂體內(nèi)膜及赤道部膜上，當(dāng)精子頭部進(jìn)入卵透明帶時(shí)，頂體酶原被活化為頂體酶水解卵透明帶，使精子穿過(guò)卵透明帶最終與卵子融合。本研究結(jié)果對(duì)照組精子頂體酶活性（93.50±32.70）?IU/106精子，不育組精子頂體酶活性為（69.40±31.50）?IU/106精子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明男性不育癥患者的精子頂體酶活性低于正常生育男性的精子頂體酶活性，是判斷精子生育力很有價(jià)值的一項(xiàng)指標(biāo)[2-4]。

既往研究表明，男性不育可能與精子DNA損傷緊密相關(guān)，本研究結(jié)果與不育正相關(guān)的精子DNA斷裂水平高于生育男性[5]。有研究發(fā)現(xiàn)有精液指標(biāo)正常的特發(fā)性不育患者。其精子DFI也增高[6]。精子DNA碎片其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為與精子發(fā)生過(guò)程中異常的染色質(zhì)包裝、氧壓脅迫或凋亡異常有關(guān)，最常用的檢驗(yàn)方法為精子染色體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)[7]。有研究報(bào)道精子DNA碎片化程度與IVF和胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）的受精率呈顯著負(fù)相關(guān)，DNA碎片化的精子形成原核障礙導(dǎo)致受精率降低，當(dāng)DNA碎片化的精子比例超過(guò)10%時(shí)，受精率明顯降低。精子DNA碎片化會(huì)導(dǎo)致不育、反復(fù)流產(chǎn)和助孕成功率低[8-10]。本研究中不育組精子DNA碎片率比正常生育男性的高，但影響不育的機(jī)制尚未完全明了，可對(duì)不育組最后需要行體外受精-胚胎移植技術(shù)助孕的患者提供最終受精資料。

去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)[11]用容易獲得的去掉透明帶的倉(cāng)鼠卵代替人卵，把人精子與去透明帶倉(cāng)鼠卵子混合，培養(yǎng)觀察受精的百分比評(píng)價(jià)精子受精能力，國(guó)外多數(shù)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道結(jié)果時(shí)以低于10%～15%卵受精率為異常，已被證實(shí)是評(píng)價(jià)精子授精能力的一種可靠技術(shù)，但其操作比較復(fù)雜，影響其大范圍開展。去透明帶倉(cāng)鼠卵人精子穿透實(shí)驗(yàn)包含獲能和頂體反應(yīng)兩個(gè)過(guò)程的，本研究結(jié)果示不育組卵子受精指數(shù)值均與正常生育男性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這與其他文章的結(jié)果不一致，可能的原因是本研究的不育組男性可能不存在獲能與頂體反應(yīng)異常問(wèn)題。

本研究分析精子功能參數(shù)與不育的相關(guān)回歸分析結(jié)果是，精子正常形態(tài)率（r=-0.823，P<0.05）、頂體酶活性（r=-0.723，P<0.05）與不育呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與不育正相關(guān)相關(guān)的有頭部畸形率（r=0.894，P<0.05）、DNA碎片率（r=0.778，P<0.05）。從數(shù)據(jù)顯示，精子正常形態(tài)率尤其是頭部畸形率對(duì)不育的相關(guān)性更強(qiáng)，對(duì)不育的治療方案的選擇指導(dǎo)意義更大。

總之，本研究結(jié)果顯示精子形態(tài)分析、頂體酶定量、精子DNA碎片檢測(cè)被證明是檢測(cè)精子功能的有效指標(biāo)，操作簡(jiǎn)單，應(yīng)廣泛臨床應(yīng)用，結(jié)合精子常規(guī)檢查能為不育男性的治療方案（自然受孕、人工授精、體外受精-胚胎移植技術(shù)）[12-14]提供更有效、全面的根據(jù)，為患者提供有效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的助孕方案。

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（收稿日期：2014-12-01）endprint