徐森懋++黃亞玲

[摘要] 目的 觀察兒童病毒性腦炎治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，探討外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化對重癥病毒性腦炎預(yù)后判斷的意義。 方法 選取23例重型病毒性腦炎患兒為研究對象，以重型病毒性腦炎患者年齡及性別為依據(jù)，1∶1配對選取輕型病毒性腦炎及正常體檢兒童組成輕癥組及對照組；流式細(xì)胞儀檢測治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比；輕型病毒性腦炎按腦炎常規(guī)治療，重型者在常規(guī)治療同時應(yīng)用甲強(qiáng)龍沖擊治療+大劑量IVIG治療；以出院時無明顯神經(jīng)系統(tǒng)異常歸為預(yù)后良好組，仍遺留各種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙或死亡者歸為預(yù)后不良組。 結(jié)果 重癥組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4/CD8值較輕型組與對照組明顯減低（P<0.01）；重型組CD8+T、CD19+B淋巴細(xì)胞百分比較輕型組與對照組顯著升高（P<0.01）； CD16+、CD56+、NK細(xì)胞百分比各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重型組預(yù)后良好者CD8+T細(xì)胞百分比治療后明顯低于治療前（P<0.01）；CD19+B細(xì)胞百分比明顯低于治療前（P<0.01）；預(yù)后差組治療前后CD8+T、CD19+B細(xì)胞百分比無明顯差別（P>0.05）。 結(jié)論 重癥病毒性腦炎患兒存在T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫功能紊亂；治療后CD8+T細(xì)胞百分比、CD19+ B細(xì)胞百分比無明顯變化提示預(yù)后不良，甲強(qiáng)龍沖擊+大劑量IVIG治療可能影響CD8+T細(xì)胞及CD19+ B細(xì)胞百分比。

[關(guān)鍵詞] 病毒性腦炎；淋巴細(xì)胞亞群；預(yù)后；IVIG

[中圖分類號] R725.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）24-14-05

Study on peripheral blood lymphocyte subsets in children with viral encephalitis

XU Senmao1 HUANG Yaling2

1.Department of Pediatric，Anqing Municipal Hospital，Anqing 246003，China；2.Department of Pediatric，the Affiliated Union Hospital of Huazhong Univercity of Science and Technology，Wuhan 430074，China

[Abstract] Objective To observe the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in children with viral encephalitis before and after treatment；to study the significant of the prognosis of the changes of peripheral blood lymphocyte subsets. Methods 23 cases of severe viral encephalitis children were selected as the research object，according to the age and sex，1：1 light viral encephalitis and normal children composition and the control group before and after treatment in mild group；detection of peripheral blood lymphocyte subsets and the percentage of flow cytometry；light viral encephalitis by encephalitis conventional treatment，heavy application of methylprednisolone therapy with high-dose IVIG treatment at the same time in the conventional treatment；at discharge with no obviousneurological abnormalities into good prognosis group，still left over various neurological dysfunction or deathattributed to the poor prognosis group. Results The percentage of CD3+，CD4+T lymphocyte，CD4/CD8 value of the severe group was significantly lower than that of the light group and the control group（P<0.01）；The percentage of CD8+T，CD19+B lymphocyte in severe group increased significantly more than that of the light group and the control group（P<0.01）；no statistical differences between the percentages of CD16+，CD56+，NK cells in each group.The severe group have good outcome and the percentage of CD8+T cells after treatment was significantly lower than that before treatment（P<0.01）；the percentage of CD19+B cells was significantly lower than that before treatment （P<0.01）；the percentage of CD8+T，CD19+B cells of the poor prognosis group had no significant difference between before and after treatment（P>0.05）. Conclusion T cell and B cell immune function disorder exists in children with severe viral encephalitis；after treatment，the percentage of CD8+T cell and CD19+B cells had no obvious change indicates a poor prognosis，methylprednisolone+high dose IVIG treatment may affect the percentage of CD8+T cells and CD19+B cells.endprint

[Key words] Viral encephalitis；Lymphocyte subsets；Prognosis；IVIG

病毒性腦炎的病情進(jìn)展及預(yù)后和機(jī)體的免疫功能關(guān)系密切。但是，病毒性腦炎患兒臨床表現(xiàn)的輕重程度及預(yù)后是否與外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞變化存在相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。免疫調(diào)節(jié)劑（甲基強(qiáng)的松龍和IVIG）越來越多的應(yīng)用于重癥病毒性腦炎，但甲強(qiáng)龍沖擊療法和大劑量IVIG應(yīng)用是如何調(diào)節(jié)病毒性腦炎患兒機(jī)體的免疫狀態(tài)，有待進(jìn)一步研究。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)檢測治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞及NK細(xì)胞水平變化，探討病毒性腦炎的免疫學(xué)機(jī)制以及甲強(qiáng)龍沖擊療法和大劑量IVIG應(yīng)用影響機(jī)體免疫功能的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例來源于2009年6月～2012年12月安慶市立醫(yī)院兒科收治的重型病毒性腦炎患兒23例，其中男14例、女9例，男女比例1.6∶1，年齡9個月～4歲，其中9～12個月3例，1～2歲10例，2～3歲7例，3～4歲3例。以重癥患兒年齡及性別按1∶1配對選取輕癥病毒性腦炎患兒23例為輕型組；體檢中心正常體檢兒童23例作對照組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 輕型病毒性腦炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[1] （1）急性起病，發(fā)病前2周內(nèi)有呼吸道感染或腸道感染病史，或明確病毒感染病史，如手足口病、輪狀病毒檢查陽性；（2）有腦膜或腦實(shí)質(zhì)損害的臨床表現(xiàn)如腦膜刺激征、精神癥狀、抽搐、肢體癱瘓、失語、意識障礙等；（3）腦電圖異常伴或不伴頭顱CT/MRI檢查異常；（4）腰穿腦脊液檢查結(jié)果符合病毒性腦炎改變；（5）經(jīng)病毒性腦炎診療常規(guī)治療后有效或好轉(zhuǎn)；（6）排除其他中樞感染性疾病如化膿性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎及腫瘤、中毒性腦病等。

1.2.2 重型病毒性腦炎分型標(biāo)準(zhǔn)[2] 診斷輕型病毒性腦炎，且符合以下2條及2條以上：（1）反復(fù)抽搐或驚厥持續(xù)狀態(tài)；（2）出現(xiàn)明顯意識狀態(tài)改變和精神癥狀如昏迷；（3）肢體運(yùn)動功能障礙，肌張力異?；虬c瘓；（4）出現(xiàn)腦干癥狀呼吸節(jié)律改變、無自主呼吸等。

1.3 治療方法

輕型組入院后常規(guī)給予控制高熱、控制抽搐（地西泮，苯巴比妥，咪達(dá)唑倫）、脫水降顱壓（甘露醇，甘油果糖，呋塞咪）、抗病毒（利巴韋林，阿昔洛韋，更昔洛韋）等處理；重型組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予甲基強(qiáng)的松龍（輝瑞制藥有限公司，MG0629200509，0.5g/支）沖擊治療[20mg/（kg·d），用藥3d，減量至1～2mg/（kg·d），用藥3～5d]，同時予大劑量IVIG（成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，S19993042，50mL/瓶）靜脈輸注[1g/（kg·d），用藥2d]，頻繁驚厥者加用丙戊酸鈉治療。

1.4 預(yù)后評估

出院時無明顯神經(jīng)系統(tǒng)異常者歸為預(yù)后良好組；出院時仍遺留各種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙或死亡病例歸為預(yù)后不良組。

1.5 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測方法

收集各組病例晨起空腹靜脈血，重型組病例于甲強(qiáng)龍沖擊+大劑量IVIG應(yīng)用結(jié)束7d后再次采集靜脈血，由專人采用美國BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測，試劑CD45PERCP/CD3FITC/CD8PE/CD4APC及CD45PERCP/CD3FITC/CD16PE+CD56PE/CD19APC均源自美國BD公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料測定結(jié)果用（）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法，治療前后方差齊性的計(jì)量資料比較采用配對t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料測定結(jié)果用中位數(shù)P50（P25，P75）表示，采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重型組12例（52.17%）預(yù)后良好

11例（47.83%）預(yù)后不良，其中死亡1例，因無自主呼吸而不能脫機(jī)達(dá)30d家長放棄治療1例，出院時診斷腦炎繼發(fā)性癲癇6例（其中伴運(yùn)動障礙3例，伴智力倒退2例），智力倒退2例，語言障礙1例。

2.2 各組間T淋巴細(xì)胞亞群比較

CD3+、CD4+T細(xì)胞百分比對照組、輕型組、重型組，差異不全相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中，CD3+T細(xì)胞百分比輕型組較對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），重型組較輕癥組下降；重型組較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD4+T細(xì)胞百分比輕型組較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），重型組較輕癥組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；重型組較對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CD8+T細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+值輕癥組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），重型組較輕癥組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；重型組較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 各組間B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞比較

CD19+B淋巴細(xì)胞 對照組、輕型組、重型組依次增高（P<0.01），其中，輕型組較對照組無顯著差異（P>0.05），重型組較輕型組明顯增高（P<0.01）；重型組較對照組明顯增高（P<0.01）；NK細(xì)胞CD16+、CD56+百分比對照組、輕型組、重型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 預(yù)后好組治療前后各組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較

預(yù)后好組治療后CD3+T細(xì)胞百分比較治療前上升（P<0.05），CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+較治療前上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞百分比較治療前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）、NK細(xì)胞百分比治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。endprint

2.5 預(yù)后差組治療前后各組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較

預(yù)后差組治療后CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+較治療前上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD8+ T細(xì)胞、CD19+B、NK細(xì)胞百分比治療前差別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

病毒性腦炎的急性期病理變化表現(xiàn)為大量病毒入侵腦組織后導(dǎo)致腦組織的直接破壞；同時宿主對病毒抗原發(fā)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，將進(jìn)一步導(dǎo)致脫髓鞘、血管與血管周圍腦組織損害。病毒性腦炎的病情進(jìn)展及預(yù)后和機(jī)體的免疫功能關(guān)系密切，在本研究中，重型組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+值較輕型組與對照組明顯減低（P<0.01）；CD4+T細(xì)胞為輔助性淋巴細(xì)胞，主要作用是分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中其他細(xì)胞的活性，Miao等[3]發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重腦損傷患者中CD3+、CD4+數(shù)量下降，CD4+T淋巴細(xì)胞百分比下降提示重癥病毒性腦炎患兒機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能受到抑制，從而致患兒免疫功能紊亂；同時，重型組CD8+T、CD19+B淋巴細(xì)胞百分比較輕型組與對照組顯著升高（P<0.01）；CD8+T細(xì)胞的主要生物學(xué)作用為抗胞內(nèi)微生物感染，發(fā)揮特異性殺傷靶細(xì)胞的功能，從而引起靶細(xì)胞的溶解與調(diào)亡，有利于病毒的清除，但同時這種特異性殺傷靶細(xì)胞的功能若過度激活，也對腦組織損害造成嚴(yán)重?fù)p害，有學(xué)者應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測因繼發(fā)嚴(yán)重的局灶性癲癇而行手術(shù)治療單純皰疹病毒性腦炎患兒的腦標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)腦實(shí)質(zhì)有大量CD8+T淋巴細(xì)胞，并提出可能是由于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)導(dǎo)致了單純皰疹病毒性腦炎患者的腦損傷[4]；孫廣超等[5]報道危重癥手足口病患兒表現(xiàn)為B細(xì)胞百分比明顯升高。病毒感染改變了突宿主細(xì)胞膜的膜抗原，病毒抗原與宿主細(xì)胞的交叉免疫反應(yīng)，CTL細(xì)胞導(dǎo)致病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞溶解后，溶解物作為抗原刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生自身抗體從面引起神經(jīng)組織的損傷。數(shù)據(jù)表明CD16+、CD56+、NK細(xì)胞百分比各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NK細(xì)胞無需抗原刺激，無需預(yù)先致敏，具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)，且作用迅速，在體外將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞混合后4h內(nèi)即可發(fā)揮殺傷效應(yīng)，在體內(nèi)NK細(xì)胞通過趨化作用聚集至感染部位，在細(xì)胞因子的作用下活化，發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的作用，這種作用發(fā)生于特異性免疫反應(yīng)之前甚至發(fā)生于病毒復(fù)制之前，而在病毒感染中后期無顯變化[6]。

在預(yù)后方面，重型者在常規(guī)治療同時應(yīng)用甲強(qiáng)龍沖擊治療+大劑量IVIG治療后，重型組預(yù)后良好者CD8+T細(xì)胞百分比治療后明顯低于治療前（P<0.01）；CD19+B細(xì)胞百分比明顯低于治療前（P<0.01）；預(yù)后差組治療前后CD8+T、CD19+B細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。病毒入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前已通過病毒血癥感染到各器官，在局部組織對病毒感染產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，當(dāng)炎癥反應(yīng)過度時則可引起SIRS和（或）MODS[7]，而甲強(qiáng)龍沖擊可有效抑制過度的炎癥反應(yīng)；徐娟等[8]研究表明糖皮質(zhì)激素應(yīng)用后會出現(xiàn)CD8+T細(xì)胞減少，用糖皮質(zhì)激素的目的是減少過強(qiáng)的免疫反應(yīng)對組織的損傷，甲強(qiáng)龍的劑量一直有爭議，在本研究中采用大劑量甲強(qiáng)龍后有5例出現(xiàn)消化道出血[9]，但對癥處理后均好轉(zhuǎn)，故用藥劑量及時機(jī)選擇十分重要，也值得進(jìn)一步研究探討；有研究表明IVIG通過可下調(diào)患兒血中IL-6和TNF-α等損傷性細(xì)胞因子水平，從面緩解腦組織的損傷[10]，Amran等 [11]認(rèn)為免疫球蛋白通過干預(yù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生而抑制T細(xì)胞活化與增殖，Dennert等[12]報道應(yīng)用IVIG治療后李自普等研究表明兒童重癥病毒性腦炎應(yīng)用丙種球蛋白后，其預(yù)后較未應(yīng)用丙種球蛋白組明顯要好，與本文有相似之處；有研究表明大劑量IVIG輸注有治療癲癇的作用，同時使體內(nèi)IgG水迅速增高，從而反饋性抑制了CD19表達(dá)，繼而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用[13]。

綜上所述，重癥病毒性腦炎患兒存在T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫功能紊亂；甲強(qiáng)龍沖擊+大劑量IVIG治療后，預(yù)后較好者CD8+T及CD19+B細(xì)胞細(xì)胞百分比治療后明顯低于治療前（P<0.01）；預(yù)后差組治療前后CD8+T、CD19+B細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從而推測甲強(qiáng)龍沖擊+大劑量IVIG治療有可能影響患兒CD8+T細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞百分比，對恢復(fù)重癥病毒性腦炎患兒異常的免疫狀態(tài)有一定作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 吳保敏，王華，葉露梅，等.小兒病毒性腦炎診斷與治療[J].實(shí)用兒科雜志，2004，19（7）：385-402.

[2] 黃如訓(xùn)，梁秀齡，劉焯霖.臨床神經(jīng)病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：156.

[3] Miao YL，Zhang MX，Nie YL.Changes in T lymphocyte subsets after severe traumatic brain injury[J].Neural Regeneration Research，2007，2（2）：126-128.

[4] Lellouch-Tubiana A，F(xiàn)ohlen M，Robain O，et al. Immunocytochemical characterization of long-term persistent immune activation in human brain after herpes simplex encephalitis [J].Neuropathol Appl Neurobiol，2000，26（3）：285-294.

[5] 孫廣超，楊思達(dá)，陶建平，等.重癥和危重癥手足口病患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群分析[J].中國循證兒科雜志，2010，5（4）：251-255.

[6] French AR，YokoyamaWM.Naturalkiller cells and viral infections[J].Curr Opin Immunol，2003，15（1）：45-51.

[7] 李爾珍.兒童急性病毒性腦炎的診治進(jìn)展[J].小兒急救醫(yī)學(xué)，2005，12（3）：230.

[8] 徐娟，惠吳函，劉聰艷.82例SARS患者T細(xì)胞亞群的變化與肺內(nèi)病變的關(guān)系[J].免疫學(xué)雜志，2003，19（5）：329-331.

[9] 陳實(shí).靜脈注射免疫球蛋白治療新生兒缺氧缺血性腦病的臨床與免疫學(xué)機(jī)理研究[J].中華兒科雜志，2000，38（3）：140-143.

[10] Matsumoto T，Tamaki T，Kawakami M，et al.Early complications of high-dose methylprednisolone sodium succinate treatment in the follow-up acute cervical spinal cord injury[J].Spine，2001，26（4）：426-430.

[11] Amran D，Renz H，Lack G，et al.Suppression of Cytokine-Dependent Human T-Cell Proliferation by Intravenous Immunoglobulin to activation of T cells by staphylococcal toxinsuperantigens [J].J Clin Immunol Immunopathol，1994，73：180.

[12] 李自普，曹敬梅.靜脈注射大劑量人體丙種球蛋白對兒童重癥病毒性腦炎預(yù)后的影響[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，38（3）：196-199.

[13] 羅向陽，李平甘，李棟方，等.免疫球蛋白治療兒童癲癇的療效及機(jī)制分析[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9（3）：299-304.

（收稿日期：2014-08-18）endprint