孫曉麗，李樹峰，佟慧麗，張偉偉，殷紅艷，嚴(yán)云勤

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

不同肌肉特異性啟動(dòng)子IGF2表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

孫曉麗，李樹峰，佟慧麗，張偉偉，殷紅艷，嚴(yán)云勤*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

旨在獲得帶有高效特異性啟動(dòng)子的IGF2表達(dá)載體，研究其對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響。本研究將構(gòu)建的3種含有IGF2肌肉特異性啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)IGF2的相對(duì)表達(dá)量，從而篩選高效特異性的載體，并進(jìn)行EdU試驗(yàn)及細(xì)胞周期相關(guān)基因RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果，成功構(gòu)建了不同啟動(dòng)子desminpro、CMV-MyoGpro和MyoGpro-double表達(dá)IGF2的載體。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，pGL3-desminpro-IGF2是較高效的并具有特異性的載體。載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞提高了細(xì)胞增殖速度，并上調(diào)了細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6和IGF2的表達(dá)。這為轉(zhuǎn)基因肉牛的生產(chǎn)奠定了重要基礎(chǔ)。

IGF2；肌肉特異性啟動(dòng)子；骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；細(xì)胞增殖

胰島素樣生長(zhǎng)因子2 (Insulin-like growth factor 2，IGF2)是由67個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)[1-2]，是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子[3]，它調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及程序性細(xì)胞死亡，對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要作用[4-5]。研究表明，與野生型小鼠相比，IGF2基因敲除小鼠的體重減少了40%[6]，S.Hayashi等得到了同樣的研究結(jié)果，證明IGF2 在牛的骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[7]。近年來(lái)，對(duì)IGF2在促增殖方面的研究越來(lái)越多，但通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法探索IGF2對(duì)家畜肌肉生長(zhǎng)影響的研究還較少。

為了提高外源基因在肌肉組織中的表達(dá)效率，啟動(dòng)子的選擇是一個(gè)重要的因素。特異高效啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)[8]。目前，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子是外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)常選用的啟動(dòng)子之一，CMV啟動(dòng)子雖然高效但幾乎沒(méi)有細(xì)胞特異性，而且考慮到轉(zhuǎn)基因的生物安全性，不能將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因肉牛的生產(chǎn)中。本研究構(gòu)建出3種含有肌肉特異性啟動(dòng)子的IGF2真核表達(dá)載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及IGF2表達(dá)量檢測(cè)，篩選出具有較高活性和較強(qiáng)肌肉特異性的IGF2表達(dá)載體，使其能夠促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖，為提高肌肉產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因肉牛的生產(chǎn)提供重要幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體 菌株DH5α、pMD18-T克隆載體購(gòu)于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1(+)，pMD18-T-desminpro，pMD18-T-CMV-MyoGpro pMD18-T-MyoGpro-double菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2 工具酶、試劑盒和其他試劑 限制性內(nèi)切酶和 LATaq 聚合酶等購(gòu)于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；Tissue DNA Kit I和Endo-Free PlasmidMini kit II購(gòu)于Omega公司；Plasmid Mini Kit I和Gel Extraction Kit I購(gòu)于北京TransGen生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)于 Invitrogen 公司；SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 購(gòu)于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；Cell-LightTMEdU Apllo 488InvitroKit購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂糖、酵母提取物、氯化鈉等購(gòu)自Sigma公司，DMEM、Opti-MEM、胎牛血清和馬血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 牛IGF2基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank公布的牛IGF2基因序列AC_000186.1，設(shè)計(jì)IGF2引物，上游引物F:ccggaattcTCAATGGGGATCACAGCAGGAAAGT(小寫部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物R:cccaagcttGCTCACTTCTAATCGCTGGATGCCT(小寫部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以牛全基因組為模板擴(kuò)增IGF2基因全序列。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。回收PCR產(chǎn)物與PMD-18T克隆載體連接，雙酶切鑒定正確后命名為pMD-18T-IGF2，送由北京英駿公司測(cè)序。

1.2.2 表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-IGF2的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切獲得目的片段，用同樣的酶雙酶切pcDNA3.1(+)載體，回收純化后，用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-IGF2載體。

1.2.3 pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2、pGL3-MyoGpro-Double-IGF2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切pMD18-T-desminpro、pMD18-T-CMV-MyoGpro、pMD18-T-MyoGpro-double獲得desminpro、CMV-MyoGpro、MyoGpro-double 3種肌肉特異性啟動(dòng)子，膠回收小片段，用同樣的酶雙酶切pcDNA3.1(+)-IGF2載體，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，構(gòu)建3種中間載體，然后用NheⅠ和XhoⅠ分別雙酶切3個(gè)中間載體膠回收小片段，用同樣的酶雙酶切pGL3-Basic，用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，構(gòu)建3種最終載體。

1.2.4 熒光定量RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化 Lipofectamine 2000 Reagent將構(gòu)建3種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞和牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。48 h后用TRIzol法提取各細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。分別檢測(cè)IGF2、P27、CDK6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化情況，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。RT-PCR擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，無(wú)菌水補(bǔ)平體系至20 μL。RT-PCR反應(yīng)條件： 95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，共45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 EdU檢測(cè) 用Lipofectamine 2000 Reagent將pGL3-Basic和pGL3-desminpro-IGF2兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染接種于12孔板中細(xì)胞匯合度為90%的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，48 h后，用EdU 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖率。

表1 熒光定量引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

Table1 The sequences of qRT-PCR primers and the product length

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpProductlength退火溫度/℃AnnealingtemperatureIGF2S:GCCTTCGCCTCGTGCTGCTAA:ACGGCTGCGTCGGTTTATGC14460P27S:GGCGTCAGACGTAAAA:CTTGGAGTCAGCGATA12149CDK6S:ATAAGCCAAGTTTCCCCAAGTGA:TGAGTGCTAAGGCAACCAGACA30258RPS18S:GTGGTGTTGAGGAAAGCAGACAA:TGATCACACGTTCCACCTCATC7960

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件包計(jì)算各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及標(biāo)準(zhǔn)誤差，并對(duì)各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 牛IGF2基因的克隆與中間載體pcDNA3.1(+)-IGF2的構(gòu)建

以牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞基因組DNA為模板，用IGF2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在相應(yīng)位置出現(xiàn)明亮條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果分析表明，IGF2測(cè)序結(jié)果與GenBank發(fā)表序列的同源性為100%，表明成功擴(kuò)增牛的IGF2基因。將pcDNA3.1(+)-IGF2重組質(zhì)粒用KpnI和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，在5 428和551 bp左右處各有一條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 不同啟動(dòng)子表達(dá)牛IGF2載體的構(gòu)建與鑒定

pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2 和pGL3-MyoGpro- Double-IGF2 3種重組質(zhì)粒分別用NheⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，pGL3-desminpro-IGF2在4 818和851 bp處各有一條特異性條帶，pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2在4 818和1 373 bp處有一條特異性條帶，pGL3-MyoGpro- Double-IGF2在4 818 和1 090 bp處各有一條特異性條帶(圖1)，結(jié)果表明，3種肌肉特異性啟動(dòng)子和IGF2基因的CDS區(qū)成功連接到重組質(zhì)粒中，與預(yù)期結(jié)果相符。

M．DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；1．PCR擴(kuò)增IGF2 CDS區(qū)結(jié)果；2．pcDNA3.1(+)-IGF2的Kpn I和EcoR I雙酶切結(jié)果；3．pGL3-desminpro-IGF2的NheⅠ和XhoⅠ雙酶切結(jié)果；4．pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2的NheⅠ和Xho Ⅰ雙酶切結(jié)果；5．pGL3-MyoGpro- Double-IGF2的NheⅠ和XhoⅠ雙酶切結(jié)果M．DL5000 marker；1． PCR product of IGF2 CDS；2．pcDNA3.1(+)-IGF2 plasmid digested with Kpn Ⅰ and EcoR Ⅰ；3．pGL3-desminpro-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ；4．pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ；5．pGL3-MyoGpro- Double-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果和重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.1 The result of PCR amplification and the recombinant plasmid by double digested with restriction enzymes

2.3 RT-PCR檢測(cè)3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后IGF2的表達(dá)變化

將3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置pcDNA3.1(+)-IGF2為陽(yáng)性對(duì)照，pGL3-Basic為陰性對(duì)照，control為空白對(duì)照，48 h以后收集細(xì)胞。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，pGL3-desminpro-IGF2組的IGF2的表達(dá)水平顯著高于其他兩組(P<0.05)，且具有較好的肌肉特異性(圖2)，所以選擇效果較好的pGL3-desminpro-IGF2質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

*.差異顯著(P<0.05)；** .差異極顯著(P<0.01)。圖4、圖5同*.Means differ significantly (P<0.05)；** .Means highly differ significantly (P<0.01).The same as Figure 4 and Figure 5圖2 各組間IGF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 IGF2 relative expression in different groups

2.4 EdU檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGL3-desminpro-IGF2后對(duì)細(xì)胞增殖的影響

重組質(zhì)粒pGL3-desminpro-IGF2和對(duì)照組pGL3-Basic轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，48 h后用EdU試劑盒檢測(cè)增殖變化(圖3)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGL3-desminpro-IGF2后細(xì)胞增殖率為17.95%，轉(zhuǎn)染pGL3-Basic后細(xì)胞增殖率為14.10%，pGL3-desminpro-IGF2與對(duì)照組相比增殖率為27.31%(圖4)，結(jié)果表明pGL3-desminpro-IGF2能夠促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

2.5 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGL3-desminpro-IGF2后細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化

用pGL3-desminpro-IGF2轉(zhuǎn)染牛骨胳肌衛(wèi)星細(xì)胞，48 h后，熒光定量RT-PCR檢測(cè)IGF2、P27和CDK6的表達(dá)變化。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞P27表達(dá)下降，而CDK6表達(dá)上升，差異均顯著(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

近年來(lái)，IGF2促進(jìn)肌肉增殖的相關(guān)研究越來(lái)越受到關(guān)注，細(xì)胞試驗(yàn)證明，IGF2是肌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的自分泌信號(hào)。A.Levinovitz等報(bào)道，在大鼠的骨骼肌再生過(guò)程中，IGF2 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)[9]。IGF2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。IGF2可以刺激DNA合成和細(xì)胞復(fù)制，推動(dòng)細(xì)胞完成增殖周期[10-11]。本試驗(yàn)利用的是實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的3種具有特異性且活性相對(duì)較高的3種啟動(dòng)子，Desminpro(300)是牛結(jié)蛋白基因大小為300 bp啟動(dòng)子，它活性較高，其啟動(dòng)基因表達(dá)的能力是人骨骼肌α-actin啟動(dòng)子和肌酸激酶啟動(dòng)子的2倍[12]；CMV-MyoGpro是MyoG基因啟動(dòng)子之前連接了一段CMV增強(qiáng)子序列，在C2C12細(xì)胞中CMV-MyoGpro復(fù)合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性較牛MyoG啟動(dòng)子而言提高了9倍左右，達(dá)到了強(qiáng)啟動(dòng)子CMV啟動(dòng)子的72%，相比牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，CMV增強(qiáng)子提高轉(zhuǎn)錄活性的效果更明顯；MyoGpro-double 是含有兩個(gè)拷貝數(shù)調(diào)控元件的MyoG啟動(dòng)子片段，其轉(zhuǎn)錄活性顯著高于普通MyoG基因啟動(dòng)子，約為MyoG基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的3.8倍[13]，3種啟動(dòng)子都具有較高的活性和較好的肌肉特異性[12-14]。本研究克隆了長(zhǎng)度為551 bp牛IGF2基因的CDS序列，并構(gòu)建出帶有相應(yīng)肌肉特異性啟動(dòng)子IGF2真核表達(dá)載體，即pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2和pGL3-MyoGpro-Double-IGF2。pGL3-desminpro-IGF2載體轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后能夠高效特異性表達(dá)，且能夠促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。IGF2通過(guò)下調(diào)CDKs蛋白抑制因子P27的表達(dá)，上調(diào)CDK6的表達(dá)，加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期的轉(zhuǎn)變[15-16]，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖作用。本研究通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)P27和CDK6的表達(dá)，結(jié)果顯示，P27表達(dá)下降，而CDK6表達(dá)上升，均呈顯著性差異(P<0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。pGL3-desminpro-IGF2在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中高效特異性表達(dá)，并促進(jìn)成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，推測(cè)其原因除了在desminpro肌肉特異性啟動(dòng)子的啟動(dòng)作用之外，IGF2的高表達(dá)在肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮了重要的作用，因此該表達(dá)載體的應(yīng)用能夠?yàn)檗D(zhuǎn)基因肉牛的生產(chǎn)提供重要幫助。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL3-Basic和pGL3-desminpro-IGF2，48 h后用EdU試劑盒檢測(cè)增殖變化，綠色代表EdU陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核Cells transfected with pGL3-Basic and pGL3-desminpro-IGF2 were detected by EdU kit for proliferation changes，green is for EdU positive cells，blue is DAPI staining of nuclei圖3 EdU增殖試驗(yàn)結(jié)果 200×Fig.3 Proliferation results of EdU 200×

圖4 EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率Fig.4 Percentage of EdU-positive cells

圖5 各組間不同基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Different genes relative expression in different groups

4 結(jié) 論

本研究獲得了能夠在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中高效特異性表達(dá)的真核表達(dá)載體pGL3-desminpro-IGF2，其在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的高效特異性表達(dá)，并促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。

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(編輯 郭云雁)

The Construction of Different Muscle-specific Promoter IGF2 Expression Vector and Its Impact on Bovine Skeletal Muscle Satellite Cell Proliferation

SUN Xiao-li，LI Shu-feng，TONG Hui-li，ZHANG Wei-wei，YIN Hong-yan，YAN Yun-qin*

(CollegeofLifeScience，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

The aim of this study was to construct IGF2 expression vector with efficient and specific promoter and study its effects on bovine skeletal muscle satellite cell proliferation.The 3 eukaryotic expression vectors containing IGF2 and muscle-specific promoter were transfected into bovine skeletal muscle satellite cells and fetal fibroblasts，the relative expression of IGF2 was detected by RT-PCR to screen efficient and specific vector.EdU experiments were carried out and RT-PCR was used to detect the cell cycle-related genes.The different promoter (desminpro，CMV-MyoGpro and MyoGpro-double) IGF2 expression vectors were constructed successfully.The test results of RT-PCR showed that pGL3-desminpro-IGF2 was an efficient and specific vector.The vector transfected into cultured cellinvitroincreased the speed of cell proliferation and up-regulated the expression of cell cycle-related genes，CDK6 andIGF2.The result has laid an important foundation for the production of transgenic bovine.

IGF2；muscle-specific promoter；skeletal muscle satellite cells；cell proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.007

2014-07-01

國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)“高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉牛新品種培育”(2011ZX08007-002)

孫曉麗(1988-)，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，主要從事分子克隆與細(xì)胞增殖的研究，E-mail：965080867@qq.com

*通信作者：嚴(yán)云勤，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的研究，E-mail：yanyunqin@sohu.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)04-0555-06