孫愛喜 上海海利生物技術股份有限公司201403

大型生物制藥廠的病毒雞胚培養(yǎng)

孫愛喜 上海海利生物技術股份有限公司201403

雞胚培養(yǎng)是培養(yǎng)某些病毒的常用方法，可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗及生產(chǎn)疫苗等。現(xiàn)代化大型生物制品廠采用尿囊腔接種法培養(yǎng)病毒液用于生產(chǎn)疫苗，生產(chǎn)實踐早已證明，種蛋的質(zhì)量、抗原生產(chǎn)工藝對生成尿囊液量及其效價高低起決定作用，直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和雞免疫后的抗體水平。本文結合某些大型獸用生物制品企業(yè)生產(chǎn)案例，對病毒雞胚培養(yǎng)進行闡述。

疫苗生產(chǎn)；雞胚培養(yǎng)法；尿囊液量；病毒含量

近年來滅活苗的應用越來越廣泛，對禽病的防制也起著越來越重要的作用。雖然組織培養(yǎng)和生物工程技術的發(fā)展很快，但是雞胚培養(yǎng)技術仍因其來源充足、操作簡單和投入少等優(yōu)點被廣泛地用于病毒的分離、鑒定和抗原制備，尤其是獸醫(yī)生物制品的制造。幾種主要禽用疫苗如雞新城疫（ND）、禽流感（AI）和傳染性支氣管炎（IB）等疫苗病毒液的生產(chǎn)均采用雞胚培養(yǎng)的方法。

1　病毒雞胚培養(yǎng)

雞胚（包括鴨胚）是正在發(fā)育中的機體，多種動物病毒能在雞胚中增殖和傳代，并可用雞胚制備某些病毒抗原、疫苗和卵黃抗體等。

（1）雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點。胚體通常無菌，對接種的病毒不產(chǎn)生抗體，易于病毒增殖。雞胚來源充足，可選擇不同的日齡和接種途徑，設備和操作簡便。感染病毒的組織和尿囊液中含有大量病毒，容易采集和處理。

（2）雞胚培養(yǎng)法的缺點。雞胚用量巨大，生產(chǎn)過程中需要大量人力進行雞胚接種和收獲操作。卵黃含有因母雞免疫而產(chǎn)生的母源抗體，影響同種病毒的增殖。容易導致外源污染，細菌如沙門氏菌等，經(jīng)母雞垂直傳遞的病毒，如禽白血病病毒及新城疫、禽腦脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。

（3）雞胚培養(yǎng)接種方法及途徑。雞胚培養(yǎng)病毒根據(jù)接種途徑主要有絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、卵黃囊接種和羊膜腔接種方法，根據(jù)需要選擇適當?shù)耐緩?。尿囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒，減蛋綜合征病毒分離和增殖。病毒液接種于10～11日齡尿囊腔，每胚0.1mL。絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。選用10～12日齡雞胚制造“人工氣室”，用注射器滴2～3滴種毒液于絨毛尿囊膜，用透明膠紙覆蓋卵窗，周圍涂以熔化石蠟進行密封，氣室小孔亦用石蠟密封。所有雞胚接種完成后人工氣室向上橫放，置于孵化箱中，期間禁止翻動。卵黃囊接種主要用于蟲媒披膜病毒及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。選用6～8日齡雞胚，氣室向上垂直放置，用碘酊和酒精消毒氣室端，氣室頂端中央打孔，用滅菌注射器吸取含病毒懸液，沿氣室端小孔剌入約3cm，注入0.1～0.5mL種毒液于卵黃囊內(nèi)。石蠟封孔后置孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育。羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖。病料初次分離病毒時，羊膜腔接種法比尿囊腔接種法敏感。選用11～12日齡的雞胚，按絨毛尿囊膜接種法造“人工氣室”，撕去卵殼，并剌破絨毛尿囊膜血管較少的部位，用鈍端鑷子沿此破孔插入，夾起羊膜囊，注入0.1～0.2mL種毒液。

2　大型生物制藥廠的雞胚培養(yǎng)

目前，國內(nèi)大型生物制品廠的病毒雞胚培養(yǎng)，生產(chǎn)批次3～10萬枚/批，均采用全自動設備進行雞胚接種和抗原收獲取代人工操作，生產(chǎn)效率得以大幅提高。雞胚尿囊液收獲量及其病毒含量的多少直接影響疫苗的產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，決定生物制品的質(zhì)量。因此，做好雞胚的質(zhì)量、種毒篩選和生產(chǎn)過程關鍵點控制非常必要，如種蛋選擇、儲存及孵化前處理，雞胚孵化過程和生產(chǎn)工藝等。

（1）種蛋選擇。雞胚的質(zhì)量主要取決于種蛋質(zhì)量，要想得到效價和產(chǎn)量高的病毒液，首先要選擇優(yōu)質(zhì)種蛋，SPF種蛋最為理想。根據(jù)行業(yè)標準要求選用SPF蛋最佳，即來自不含雞22種病原體的雞群產(chǎn)的蛋，適用于生產(chǎn)各種雞用疫苗。但SPF蛋受價格高、供應量不足、禽滅活苗抗原用量大，成品苗價格不高等因素影響，禽滅活苗用非免疫種蛋生產(chǎn)。非免疫種蛋指來自于未接受特種病原體免疫和未感染此種病原體的雞群，即種蛋不含特定病原的母源抗體。大小均勻，蛋重55～65g。種蛋孵化至10日齡胚的有效率達90％以上。蛋殼表面較光滑，無糞便污染。蛋殼鈣質(zhì)均勻，無破殼、薄殼和花殼蛋。選擇不含特定病原母源抗體的非免疫種蛋，卵黃抗體水平符合質(zhì)量標準。

（2）種蛋儲存。用于疫苗生產(chǎn)的種蛋13～18℃保存期在1周以內(nèi)。胚胎發(fā)育的臨界溫度是23.9℃。高于這個溫度胚胎就會發(fā)育，低于這個溫度胚胎就會停止發(fā)育。但決不能認為種蛋儲存只要低于23.9℃就行，因為胚胎在低于23.9℃的某一溫度范圍內(nèi)，胚胎的生理代謝仍然存在，在這種條件下儲存的種蛋活力就會降低，當轉入正常孵化時胚胎衰弱，死亡增加，影響孵化效率。所以種蛋儲存時，要使胚胎的生理代謝降到最低程度，同時又不能使種蛋受凍（不得低于5℃）。

種蛋保存時間在產(chǎn)后1周內(nèi)為宜，最好控制在3～5天。種蛋保存1周以內(nèi)可不翻蛋，如保存期超過1周以上每天翻蛋1～2次，可防止胚胎與蛋殼膜粘連，有利于提高種蛋孵化率。種蛋儲存間溫度控制在13～18℃。根據(jù)各地區(qū)氣溫高低和儲存時間長短而異，種蛋保存時間短，溫度控制的高些，保存時間長，溫度適當?shù)托１４嫫谠介L，孵化效果不佳，即使在最適宜的環(huán)境下，保存期也不宜超過10天。儲蛋庫的相對濕度控制在70％～80％。種蛋在儲存期間，蛋內(nèi)水分通過蛋殼蒸發(fā)，濕度低水分蒸發(fā)快，反之水分蒸發(fā)慢。種蛋進入種蛋庫前應及時消毒，并對接觸種蛋的蛋箱、蛋托和蛋架等用福爾馬林或過氧乙酸熏蒸消毒。儲存前不能用水洗刷種蛋，否則會導致蛋殼上的膠質(zhì)膜破壞，降低種蛋品質(zhì)使孵化率降低。做好通風，使種蛋庫內(nèi)空氣新鮮不能有異味，防止產(chǎn)生臭蛋和霉蛋。

（3）種蛋孵化前的處理。入室孵化前除去種蛋表面污物，并進行消毒處理。用挑選和磨砂處理的方法去除表面有污物的種蛋。經(jīng)選擇的種蛋按28mL/m3福爾馬林、14g高錳酸鉀密閉熏蒸半小時，可殺滅蛋殼上95％～98.5％的病原體。種蛋入孵前用0.1％新潔爾滅浸泡消毒，可以防止霉菌及病原微生物增殖而污染種蛋。種蛋大頭向上置于蛋盤內(nèi)，裝蛋車推入孵箱開始孵化。

（4）雞胚孵化過程控制。高質(zhì)量雞胚需要適宜的孵化條件，包括溫度、濕度、翻蛋和通風。孵化過程中，溫度是最重要的影響因素，關系到種蛋孵化率的高低和雞胚品質(zhì)的好壞。前孵溫度設置為37.8±0.5℃，后孵溫度為37.0±0.5℃。溫度偏高導致雞胚發(fā)育過快，收獲時尿囊液量少；溫度偏低胚胎發(fā)育慢，10～11日齡的雞胚血管網(wǎng)發(fā)育不到胚蛋的小頭，種蛋蛋白不能被吸收轉化成尿囊液，收獲量也會減少。濕度前、后孵化均設置為65±5％，濕度過大，超過70％會妨礙蛋內(nèi)水分蒸發(fā)和胚胎發(fā)育；濕度過低，蛋內(nèi)水分大量蒸發(fā)，胚胎同樣發(fā)育不良且接種后尿囊液減少，影響抗原產(chǎn)量。翻蛋2小時/次，翻蛋的角度要達到左右各45°。翻蛋是胚胎正常發(fā)育不可缺少的條件之一。有報道稱翻蛋對胚胎的發(fā)育和生理學有積極作用，可保持胚外囊（尿囊、羊膜囊、蛋白囊和卵黃囊）的正常方位和胚胎的水平衡，有利于胚外囊的生長和胚胎營養(yǎng)的吸收。通風換氣直接影響胚胎正常新陳代謝和孵化效果。隨著雞胚胚齡的增長，其代謝能力增強，氧氣的需求量增多，如不及時排出污濁氣體、換入新鮮空氣，胚胎發(fā)育會受到嚴重影響，嚴重時可造成雞胚死亡率升高。

（5）生產(chǎn)工藝。生產(chǎn)工藝的影響因素包括接種和收獲時雞胚的日齡、病毒種類及接毒劑量、接種收獲設備穩(wěn)定性和接種胚收獲前冰蛋處理。接種9～11齡雞胚，13～14日齡收獲時的雞胚尿囊液量最多。種毒效價必須符合質(zhì)量標準要求，高質(zhì)量的種毒才能生產(chǎn)出合格的抗原。不同類型病毒在雞胚內(nèi)繁殖規(guī)律及對雞胚發(fā)育的影響不同，不同抗原制造執(zhí)行各自的生產(chǎn)工藝。接種開始前接種設備的管道、接種針和種毒瓶等物品滅菌處理，避免污染引起雞胚死亡。根據(jù)胚蛋大小調(diào)節(jié)接種針的進針深度，既要保證種毒接進尿囊腔內(nèi)，又要避面進針過深扎死雞胚。觀察接種針是否有彎曲和倒刺，刺破或刮斷血管造成接種胚的死亡率增加。后孵化結束后雞胚做冰蛋處理，目的是讓雞胚血管收縮，防止收獲時血管破裂紅細胞進入抗原，影響抗原質(zhì)量。-20℃冷庫2～4小時或2～8℃冷藏過夜，冰蛋時間視胚蛋總量和冷庫制冷量靈活把控。-20℃條件下控制好時間防止凍結，解凍后收獲尿囊液收獲量會減少10％～20％；2～8℃冷藏氣室向上直立4～24小時，冷藏時間過長收獲量也會減少。冷卻的雞胚取出，用消毒劑消毒氣室部位。剝除氣室部蛋殼，穿破卵殼膜和絨毛尿囊膜，通過負壓真空收取尿囊液并存放于滅菌容器內(nèi)。收獲頭的高度，真空壓力適宜，避免收獲頭過低壓破蛋黃影響抗原質(zhì)量。收獲頭過高或真空壓力過低，尿囊液收取不凈影響收獲總量。

綜上所述，病毒雞胚培養(yǎng)應用廣泛和成熟，給予適宜病毒繁殖擴增的生理生化條件，選用優(yōu)質(zhì)雞胚，控制好孵化溫濕度，按照工藝規(guī)程和崗位操作SOP組織生產(chǎn)，能得到高質(zhì)量的抗原用于制備優(yōu)質(zhì)疫苗，并獲得良好的經(jīng)濟效益。

［1］徐秀臣，王麗男.影響病毒在雞胚中增殖的因素.畜牧獸醫(yī)科技信息，2003.8.

［2］江興華.影響雞新城疫（LaSota株）活疫苗抗原病毒含量因素的探討.福建畜牧獸醫(yī)，第33卷第4期2011年.

［3］丁常春.濕度對雞胚發(fā)育的影響及實際應用，農(nóng)村科技，2000年06期.

［4］劉宇卓.雞胚培養(yǎng)技術中影響雞胚質(zhì)量的幾個問題，中國禽業(yè)導刊，1999年第6期.