徐嘉蔚 陳 斌△ 李 玲 何 琬 王國棟 劉 璇

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 (湖南 長沙，410007) 2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院醫(yī)學基礎(chǔ)教學實驗中心 3.湖南中醫(yī)藥大學研究生院

肝硬化是臨床常見的慢性進展性肝病，患者常伴有食欲減退、噯氣、早飽、腹脹、腹瀉或便秘等癥狀，然而這些癥狀與胃排空功能下降、小腸的移行性運動復(fù)合波(MMC)異常、胃腸激素紊亂等胃腸病理生理改變密切相關(guān)。在肝硬化模型大鼠中發(fā)現(xiàn)其胃腸運動減弱，排泄時間明顯延長［1］，這不僅影響食物的消化吸收，而且消化道對細菌的順性機械排空作用也減弱，導(dǎo)致腸腔內(nèi)細菌過度生長繁殖，菌群失調(diào)，細菌移位，內(nèi)毒素產(chǎn)生增加［2］，加重肝微循環(huán)障礙、促進肝纖維化［3］，形成對肝臟的“二次打擊”。本實驗著重研究肝硬化模型大鼠血清胃動素(MTL)、胃腸平滑肌細胞胃動素受體(MTL-R)、門靜脈內(nèi)毒素水平的變化，并予“肝病實脾”法的代表方逍遙散及其拆方進行干預(yù)，以探索“肝病實脾”的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，體重(120～140)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 藥物和試劑 逍遙散由柴胡、當歸、白芍、白術(shù)、茯苓、生姜、薄荷、炙甘草組成，藥物均采用單味中藥配方顆粒(廣東一方制藥有限公司);牛血清白蛋白(北京Solarbio 公司，批號:628C053);弗氏不完全佐劑(美國Sigma-Aldrich 公司，批號:1001646388);大豆胰蛋白酶抑制劑(sigma 公司，批號:1001789621);Ⅱ型膠原酶(invitrogen 公司，批號:17101015);顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，批號:140325);大鼠MTL ELISA 試劑盒、大鼠MTLR ELISA 試劑盒(美國RD 公司，批號:20140919)。

1.3 儀器 SK3003 半自動生化分析儀(深圳市盛信康科技有限公司)，722s 可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);ELX800 酶標儀(BioTek Instruments)，BX43 研究型正置顯微鏡(Olympus)，X1R 低溫高速離心機(Thermo Fisher);JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝技術(shù)公司);DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.4 藥物配制 將牛血清白蛋白液與等容積弗氏不完全佐劑混合在超聲波細胞粉碎機上乳化，配成牛血清白蛋白乳化液。實驗組用藥為逍遙散，由柴胡15g、當歸15g、白芍15g、白術(shù)15g、茯苓15g、生姜6g、薄荷6g、炙甘草9g 組成，對照組為逍遙散去健脾藥物，由柴胡15g、當歸15g、白芍15g、薄荷6g 組成。按照人與大鼠體表面積關(guān)系換算大鼠的生藥日用量，得出大鼠逍遙散日用量8.64g/kg，逍遙散去健脾藥物組日用量4.59g/kg，按照顆粒劑與生藥劑量換算關(guān)系，將生藥量換算成顆粒配方劑量，將所得逍遙散中藥顆粒劑劑量配成質(zhì)量分數(shù)為0.155g/ml 溶液，逍遙散去健脾藥物為0.079g/ml 溶液，貯于4℃冰箱備用。

1.5 動物造模方法 參照文獻方法［4］，用牛血清白蛋白致敏，模型組、對照組、實驗組每次取0.5ml 牛血清白蛋白乳化液大鼠皮下多點注射，第1 次注射后間隔14d 進行第2 次注射，之后每間隔10d 注射一次，共4 次。末次致敏后1 周，大鼠尾靜脈取血，瓊脂雙向擴散實驗檢查牛血清白蛋白抗體，取陽性抗體的大鼠進行攻擊，每周兩次尾靜脈注射牛血清白蛋白，劑量每次0.4ml，牛血清白蛋白含量自2mg/次漸加0.5mg/次至4mg/次，維持此劑量，共15 次。正常組則給予等劑量生理鹽水尾靜脈注射，末次攻擊24h 后處死。

1.6 分組與給藥 將70 只Wistar 大鼠按雌雄各半，隨機分為正常組、模型組、實驗組和對照組4 組。正常組10 只，其余各組20 只。各組于攻擊階段開始灌胃給藥，按10ml·kg-1·d-1的劑量給藥，每天灌胃1 次，直到動物處死，用藥時間為兩個月，同時正常組、模型組給予等劑量生理鹽水。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 血清肝功能指標檢測 麻醉處死大鼠，抽取門靜脈血2ml，注入促凝管中，以SK3003 半自動生化分析儀分別測定ALT、AST、TP、Alb。

1.7.2 內(nèi)毒素檢測 嚴格無菌狀態(tài)下，抽取門靜脈血lml 裝入無熱原抗凝管，3 000 rpm，離心2min，取上清液血漿標本，行內(nèi)毒素檢測，具體方法參照顯色基質(zhì)鱟試劑盒說明書。

1.7.3 血清MTL 濃度檢測 抽取右心房血2ml，注入促凝管中，3 000rpm，離心4min，取血清液，行酶聯(lián)免疫吸附檢測。

1.7.4 平滑肌細胞的制備 參照文獻方法［5］，將大鼠麻醉處死，無菌剖腹取胃，剪取胃竇(距幽門0.8-lcm)，沿胃小彎剪開，以冰冷的生理鹽水沖洗去食物殘渣后，放入冰冷的Hepes-Ringer 緩沖液中，在無菌工作臺中，除掉大網(wǎng)膜，剝?nèi){膜，用止血鉗撕去粘膜，將新鮮的胃竇平滑肌0.5g 剪成2mm×2mm 小塊，將肌塊放入裝有4ml 消化液滅菌離心管中孵育，通以100%純O2，31℃水浴30min 后，離心(1 500r/min)4min。吸去消化液，在沉渣中再加消化液4ml，通以100%純O2，31℃水浴30min 后，上述離心條件下離心4min。吸去上清液，在沉渣中加Hepes-Ringer 緩沖液4ml，搖勻后，離心4min，洗滌3 次后，肌塊重浮于含10%牛血清白蛋白的Hepes-Ringer 液中，通入100%純O2，31℃水浴振蕩(30 次/min)25min。用40 目細胞篩網(wǎng)，將平滑肌細胞過濾，得到游離的單個平滑肌細胞，并收集于充滿100%純O2的30mL 的小錐形瓶中待用。在十二指腸與空腸交界處下1cm 處剪取4cm 長的腸組織，剖開剝?nèi){膜與粘膜，洗凈，剪碎，裝入含10ml 消化液的滅菌離心管中，通入100%純O2，31℃水浴消化10 min，共2 次。消化完畢，1 800r/min 離心5min，棄上清液，加Hepes-Ringer 緩沖液洗滌2 次，棄上清液，再加入Hepes-Ringer 緩沖液10ml，通入氧氣，31℃，振蕩25min，而后用40 目細胞篩網(wǎng)過篩，充氧氣。用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)1 ×106/L，并用臺盼藍染液檢查細胞存活率(90%以上)。

1.7.5 平滑肌細胞胃動素受體(MTL-R)檢測 取上述所得的胃腸平滑肌細胞懸液，行酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s 表示，多組間計數(shù)資料比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗，相關(guān)分析采用Pearson(簡相關(guān)分析)，P ＜0.05 為差異有顯著性意義，P ＜0.01 為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠肝功能水平比較(±s)

表1 各組大鼠肝功能水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

2.2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素、MTL、MTL-R 檢測 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平，MTL、胃腸平滑肌細胞MTL-R 比較(±s)

表2 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平，MTL、胃腸平滑肌細胞MTL-R 比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01;與對照組比較，★P ＜0.05

2.3 血清ALT、AST 與門靜脈內(nèi)毒素、血清MTL、胃腸平滑肌細胞MTL-R 的關(guān)系 血清ALT、AST 與門靜脈內(nèi)毒素具有正相關(guān)(r=0.391，0.334，P ＜0.05);與血清MTL 具有負相關(guān)(r=-0.535，P ＜0.01，r=-0.35，P ＜0.05);與胃竇平滑肌細胞MTL-R 具有負相關(guān)(r=-0.68，-0.451，P ＜0.01);與空腸平滑肌細胞MTL-R 呈負相關(guān)(r=-0.727，-0.503，P ＜0.01)。

2.4 血清TP、Alb 與血清MTL、胃腸平滑肌細胞MTL-R 的關(guān)系血清TP、Alb 與血清MTL 具有正相關(guān)(r=0.419，P ＜0.01，r=0.338，P ＜0.05);與胃竇平滑肌細胞MTL-R 具有正相關(guān)(r=0.403，0.468，P ＜0.01);與空腸平滑肌細胞MTL-R 具有正相關(guān)(r=0.482，P ＜0.01，r=0.328，P ＜0.05)。

3 討論

肝脾相關(guān)理論是中醫(yī)學五臟相關(guān)理論的重要組成部分。生理上肝脾相互為用、相互協(xié)調(diào)，而根據(jù)中醫(yī)五行生克關(guān)系，肝脾在病理上也是密切聯(lián)系，相互影響傳變。肝木氣有余，制己所勝，橫逆乘脾，而成“木旺乘土”;肝氣不及，則己所勝輕而侮之，而成“木虛土壅”;脾氣不及，肝氣雖然處于正常水平，然脾土不耐克伐，則“土虛木乘”。脾有實邪亦可反侮于肝，即為脾病傳肝。治療上張仲景在《金匱要略》里提出:“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的治療原則。臨床上脾胃虛弱患者易發(fā)生惡心嘔吐、腹脹、腹瀉或便秘等癥狀，可見脾胃的納運升降功能與胃腸動力作用密切相關(guān)，而肝病患者常伴有胃腸功能障礙，脾虛因素貫徹始終［6］。故臨床在治療肝病時，常采用“肝病實脾”法，先實其脾氣，防止肝邪犯脾，導(dǎo)致疾病進一步發(fā)展。

肝硬化患者胃動素受體表達與胃排空時間具有相關(guān)性，胃竇黏膜胃動素受體表達降低可能參與了肝硬化患者胃排空障礙［7］。失代償性肝硬化時小腸的移行性運動復(fù)合波(MMC)存在異常，且與Child-Pugh 分級相關(guān)［8］。肝臟受損時釋放大量細胞因子和炎癥介質(zhì)，如前列腺素E2(PGE2)能引起胃腸運動紊亂，使胃腸移行性復(fù)合波(MMC)消失［9］。而胃動素(MTL)是一種重要的調(diào)節(jié)胃腸消化功能的胃腸激素，可直接作用于平滑肌上的胃動素受體，通過受體活化鈣通道，引起平滑肌細胞胞質(zhì)游離鈣濃度升高［10］，導(dǎo)致平滑肌收縮加強，增加移行性復(fù)合運動(MMC)，促進胃腸運動，可將空腹時吞下的唾液、胃黏液、上次進食后遺留的殘渣、脫落的細胞碎片和細菌等清除干凈，防止結(jié)腸內(nèi)的細菌在消化間期逆行入回腸，起“清道夫”的作用。而MMC 的改變及消失會引起腸道菌群失衡及上移，過度生長的細菌產(chǎn)生各種毒素，引起各種并發(fā)癥，如肝性腦病、自發(fā)性腹膜炎、腸源性內(nèi)毒素血癥等，可加重肝臟的原發(fā)疾病，形成對肝臟的“二次打擊”［11］。

逍遙散始載于《太平惠民和劑局方》，既補肝體，又助肝用，氣血兼顧，肝脾并治，故為調(diào)和肝脾之名方。臨床上常用其加減治療肝纖維化，實驗研究也發(fā)現(xiàn)逍遙散具有保肝護肝作用，減輕肝細胞變性、壞死，抑制炎細胞浸潤，阻抑肝細胞的纖維化［12］。本實驗對其拆方，將原方組與去掉健脾藥物(白術(shù)、茯苓、生姜、炙甘草)進行比較，發(fā)現(xiàn)逍遙散原方組對實驗組肝硬化大鼠的ALT、AST 下降，TP、ALB 升高，減低門脈內(nèi)毒素水平，增加MTL，胃竇及空腸平滑肌細胞MTL-R 等方面具有優(yōu)勢，說明逍遙散具有保護肝硬化大鼠肝功能以及促進胃腸動力的作用。而對照組在ALT、AST、TP、門靜脈內(nèi)毒素水平、MTL、胃竇平滑肌細胞MTL-R 等方面和模型組無差異，說明去掉健脾藥物則改善肝功能、促進胃腸動力及預(yù)防內(nèi)毒素血癥的作用明顯下降，逍遙散對肝臟的保護作用受影響。并且實驗組和對照組在增加胃竇平滑肌細胞MTL-R 方面有差異，說明健脾藥物有增加胃竇平滑肌細胞MTL-R 的功能，可能為“肝病實脾”法的作用機制之一。通過ALT、AST、TP、ALB 與MTL、胃竇及空腸平滑肌細胞MTL-R相關(guān)性方面研究，顯示可以通過直接增加MTL、胃竇及空腸平滑肌細胞MTL-R，預(yù)防內(nèi)毒素血癥，而間接恢復(fù)肝功能;以及通過恢復(fù)肝功能，間接促進胃腸動力的作用。如李東垣所說“脾胃之氣既傷，而元氣亦不能充，而諸病之所由生也”。提出“內(nèi)傷脾胃，百病由生”，元氣是健康之本，而脾胃是元氣之本，因此注重扶養(yǎng)脾胃，借以護養(yǎng)元氣，所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”。疏肝的同時加以健脾，“肝病實脾”法才能發(fā)揮綜合作用，對緩解病情、改善預(yù)后具有十分重要的意義。

［1］殷積彬，張文華，高善玲，等.肝硬化大鼠胃腸運動及胃動素受體表達的實驗研究［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2014，23(20):162-165.

［2］馮麗麗，汪曉軍.肝硬化時腸源性內(nèi)毒素血癥形成機制的研究進展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，21(9):496 -498.

［3］溫璐璐，鄧新，張曉雯.內(nèi)毒素與肝纖維化的研究進展［J］.中國醫(yī)療前沿，2010，5(2):15 -16.

［4］陳斌，孫克偉，劉明德，等.莪術(shù)對免疫性肝纖維化大鼠肝細胞膜功能的影響［J］.湖南中醫(yī)學院學報，2003，23(1):7 -8.

［5］陳斌，蔡光先，戴飛躍，等.開胃進食湯超微配方顆粒對脾虛大鼠胃腸平滑肌鈣調(diào)蛋白mRNA 表達的調(diào)節(jié)作用.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2009，17(4):224 -226.

［6］朱文芳，孫克偉，陳斌，等.乙型肝炎相關(guān)性肝衰竭不同黃疸證的腸道菌群分析［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2013，33(1):130.

［7］潘麗麗，殷積彬，高善玲，等.肝硬化患者胃動素受體表達與胃排空的研究［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2013，22(2):137 -140.

［8］Chesta J，Defilippi C.Abnormalities in proximal small bowel motility in patients with cirrhosis［J］.Hepatoloty，1993，17(5):828 -832.

［9］Sanchez E，Casafont F，Guerra I，et al.Role of intestinal bacterial overgrowth and intestinal motility in bacterial translocation in experimental cirrhosis［J］.Rev Esp Enferm Dig，2005，97(11):805-814.

［10］G.Van Assche，I.Deportere，T.Thijs，et al.Contractile effects and intracellular Ca2+signalling induced by motilin and erythromycin in the circular smooth muscle of human colon［J］.Neurogastroenterology ＆ Motility，2001，13(1):27 -35.

［11］趙龍鳳，李紅，韓德文.腸源性內(nèi)毒素血癥與肝病［J］.世界華人消化雜志，2000，8(10):1145 -1149.

［12］黃莉，金若敏.逍遙散藥理研究概況［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2003，37(9):61 -63.