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      菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rbf1的克隆及表達(dá)分析

      2015-03-24 07:20:14胡鵬張雅芬崔海峰俞曉平葉子弘
      長江蔬菜 2015年22期
      關(guān)鍵詞:茭白侵染菌絲

      胡鵬,張雅芬,崔海峰,俞曉平,葉子弘

      (中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,杭州,310018)

      菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rbf1的克隆及表達(dá)分析

      胡鵬,張雅芬,崔海峰,俞曉平,葉子弘

      (中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,杭州,310018)

      為研究菰黑粉菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換機制及灰茭形成機理,利用菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別從正常茭白中的菰黑粉菌(MT型)和灰茭中的菰黑粉菌(T型)中擴增得到Rbf1基因及開放閱讀框序列。結(jié)果表明,2種菰黑粉菌的Rbf1基因序列相同,開放閱讀框全長為1 281 bp,無內(nèi)含子,NCBI中blast及進(jìn)化分析表明,菰黑粉菌Rbf1基因與玉米黑粉菌具有較高的同源性;另外,菰黑粉菌不同生長階段的Rbf1基因的表達(dá)量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),Rbf1基因在菌絲生長前后表達(dá)量有顯著差異,在菌絲生長12 h后表達(dá)量明顯升高,表明Rbf1基因在菰黑粉菌的菌絲形成及生長過程中具有重要作用。

      菰黑粉菌;Rbf1轉(zhuǎn)錄因子;菌絲生長

      茭白(Zizanialatifolia),又稱菰、茭筍、茭白草,為禾本科菰屬多年生宿根草本植物,是原產(chǎn)于我國的一種重要水生蔬菜[1]。研究表明,茭白營養(yǎng)豐富,含有多種營養(yǎng)物質(zhì),其蛋白質(zhì)功效高于面粉、大米和大豆,具有很高的食用價值[2]。此外,茭白還具有很高的藥用價值,有研究表明,從茭白中提取出來的一種分子式為C31H54NaO3的白色晶體,能有效抑制成骨細(xì)胞的反常增殖,可用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[3]。目前茭白廣泛種植于亞洲各地,我國的種植面積也逐年增加。目前的研究認(rèn)為,茭白的產(chǎn)生與茭白植株內(nèi)的菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)的侵染互作存在較大的關(guān)系[4]。菰黑粉菌侵染茭白成功后,茭白開花受到抑制,刺激茭白莖部膨大,形成可食用的膨大莖,并且組織切片觀察發(fā)現(xiàn)正常茭白膨大莖部存在著大量的菰黑粉菌,此外在茭白地下莖、葉鞘和芽的維管束組織和薄壁組織也觀察到菰黑粉菌的分布[5,6]。田間種植發(fā)現(xiàn),除可食用的正常茭白外,通常也會發(fā)現(xiàn)大量的不可食用的灰茭。灰茭的膨大莖中充滿黑色孢子,誤食可能會造成過敏反應(yīng)[7],因此灰茭產(chǎn)生會對茭白的種植造成較大的經(jīng)濟損失。

      菰黑粉菌是黑粉菌目黑粉菌科真菌,進(jìn)化分析表明,其與玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)及玉米絲黑穗菌(Sporisorium reilianum)具有較高的親緣關(guān)系,是一種典型的二型態(tài)真菌,存在菌絲型及酵母型兩種形態(tài),其形態(tài)轉(zhuǎn)換及致病性與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有關(guān)。Heimel等[8]研究發(fā)現(xiàn),玉米黑粉菌中轉(zhuǎn)錄因子Rbf是玉米黑粉菌的侵染過程中主要調(diào)節(jié)因子,Rbf1基因缺失后,玉米黑粉菌能夠形成菌絲,但是不能產(chǎn)生附著孢,導(dǎo)致其侵染性下降。另外,研究表明,在玉米黑粉菌由酵母型形成菌絲型后,Rbf1基因能夠調(diào)節(jié)Kpp6、Hdp1、Hdp2、Biz1等基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞周期,控制真菌的生長及附著孢形成等多個致病過程[9]。在侵入植物表皮后,Rbf1能夠與Clp1形成復(fù)合物,從而調(diào)節(jié)信息素mfa及受體pra的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)菌絲的形成。

      目前認(rèn)為在正常茭中菰黑粉菌通常以菌絲型形態(tài)存在,稱之為MT型,而灰茭中則主要以酵母型形態(tài)存在,稱為T型[10,11]。本課題組前期分別從龍茭2號正常茭和灰茭中分離得到MT型和T型菰黑粉菌。以MT型菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)設(shè)計基因特異引物,分別從MT型及T型黑粉菌中擴增得到Rbf1基因,并對其進(jìn)行相應(yīng)的序列分析。利用Real-time PCR技術(shù)檢測Rbf1基因在不同形態(tài)及不同培養(yǎng)時期的相對表達(dá)量,結(jié)果表明Rbf1基因的表達(dá)與菰黑粉菌形態(tài)轉(zhuǎn)換之間存在一定的關(guān)系。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究菰黑粉菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換機制及灰茭形成機理提供了一定理論基礎(chǔ)。

      1 材料方法

      1.1 試驗材料

      ①菌株 分離自龍茭2號MT型菰黑粉菌,分離自龍茭2號灰茭的T型菰黑粉菌。

      ②主要試劑和儀器 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工),pMD19-T Vector(TaKaRa),RNAiso plus(TaKaRa),LA Taq(TaKaRa),PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa),熒光定量試劑盒(TaKaRa);普通PCR儀(Bio-Rad),核酸電泳儀(Bio-Rad),Gene Genius Bio Imaging System凝膠成像系統(tǒng),StepOneTMReal-Time PCR System(ABI),光學(xué)顯微鏡(LEICAI DMI4000B)。

      ③培養(yǎng)基 YEPS培養(yǎng)基:蛋白胨 20 g、酵母粉10 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g,加水至1 000 mL,分裝后高壓蒸汽滅菌。

      1.2 Rbf1基因的克隆

      ①菰黑粉菌Rbf1基因組序列的克隆 通過CTAB法對MT型菰黑粉菌及T型菰黑粉菌進(jìn)行總DNA提取,利用特異引物對菰黑粉菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴增,獲得其基因組相應(yīng)序列,經(jīng)克隆測序驗證。

      ②菰黑粉菌總RNA的提取 分別收集MT型和T型菌絲型及酵母型菰黑粉菌,在液氮中充分研磨成粉末,根據(jù)提取說明書提取菰黑粉菌總RNA。

      ③Rbf1基因開放閱讀框的擴增 采用Prime-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第一鏈。同時根據(jù)MT型菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計引物(表1),采用普通PCR擴增菰黑粉菌中Rbf基因,經(jīng)割膠回收后,連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,菌液驗證,挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗證。分析其結(jié)構(gòu),并比較分析其與玉米瘤黑粉菌等進(jìn)化關(guān)系。

      1.3 Rbf1基因表達(dá)模式分析

      ①樣品采集觀察。以YEPS培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菰黑粉菌,待OD600為0.8~1.0時接種于YEPS固體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)過程中的菌落形態(tài)變化,分別收集培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84h后的菌體。3次重復(fù),菌體收集后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      ②熒光實時定量PCR檢測基因的相對表達(dá)量。菰黑粉菌總 RNA的提取同 1.2,利用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用獲得的Rbf1 cDNA序列,按照qRT-PCR引物設(shè)計要求設(shè)計熒光特異性引物(表1)。以β-actin基因作為內(nèi)參基因,以不同培養(yǎng)時期的cDNA為模板進(jìn)行定量PCR擴增。熒光定量PCR采用SYBRGreenI染料法,反應(yīng)在StepOneTMReal-Time PCR System(ABI)檢測系統(tǒng)上進(jìn)行。Realtime PCR反應(yīng)液體系:qPCR反應(yīng)體系(25 μL)為:Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL,PCR正向引物(10 μmol/ L)1 μL,PCR反向引物(10 μmol/L)1 μL,ddH2O 9.5 μL,cDNA1.0μL。反應(yīng)程序為95℃30s;95℃30s,60℃15s,72℃延伸30s,進(jìn)行40個循環(huán),每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)樣品。熒光定量所得Ct值采用2-△△Ct法進(jìn)行分析[12]。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 菰黑粉菌Rbf1基因克隆及序列結(jié)構(gòu)分析

      根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,實驗設(shè)計了針對Rbf1基因的開放閱讀框(ORF)的引物,分別提取MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴增得到相應(yīng)的Rbf1基因的ORF序列,對兩種菰黑粉菌的Rbf1序列進(jìn)行比較分析。測序結(jié)果表明,兩種菰黑粉菌中的Rbf1具有相同的ORF序列,其ORF共1281bp,編碼426個氨基酸,理論分子量為109.59KDa,理論等電點為4.94。利用其編碼序列,通過MegAlign軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1A),結(jié)果表明,菰黑粉菌與玉米瘤黑粉菌及玉米絲黑穗菌具有較高的親緣關(guān)系,可能具有類似的功能。

      對菰黑粉菌Rbf1基因組序列進(jìn)行PCR擴增后得到1281bp的基因組序列。通過NCBI中的Spidey程序?qū)⒃摶蚪M序列與Rbf1cDNA序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)其不含內(nèi)含子。Rbf1包含一個保守結(jié)構(gòu)域,編碼一個核酸結(jié)合位點,同時編碼一個鋅指結(jié)構(gòu)域(圖1B)。

      2.2 菰黑粉菌Rbf1基因表達(dá)差異分析

      實驗以YEPS分別培養(yǎng)T型菰黑粉菌及MT型菰黑粉菌,每隔12h觀察生長狀況及菌落形態(tài),同時收集相應(yīng)的菌體,-80℃保存。顯微觀察結(jié)果表明,T型菰黑粉菌在培養(yǎng)36h后開始產(chǎn)生明顯菌絲(圖2A),48 h后菌絲大量生長(圖2B);MT型菰黑粉菌則在培養(yǎng)60 h后產(chǎn)生菌絲(圖2C),72 h后菌絲大量生長(圖2D)。提取不同時間段的菰黑粉菌RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實時定量PCR檢測在不同培養(yǎng)時間段Rbf1基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明,T型菰黑粉菌在培養(yǎng)48 h后,Rbf1基因的表達(dá)量達(dá)到最大,而MT型菰黑粉菌則在72 h后表達(dá)量最大,2種黑粉菌均在菌絲生長12 h后達(dá)到最大表達(dá)量(圖3)。

      3 討論與結(jié)論

      目前的研究表明,菰黑粉菌在茭白孕茭的過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在茭白孕茭的早期階段,菰黑粉菌較少,其菌絲的大量增殖可能與茭白膨大密切相關(guān)[5]。 進(jìn)化分析表明,菰黑粉菌與玉米黑粉菌具有較高的親緣關(guān)系,因此推測菰黑粉菌對茭白的侵染機制可能與玉米黑粉菌相似,都必須由酵母型形態(tài)轉(zhuǎn)換為菌絲型形態(tài),進(jìn)而侵入植物表皮細(xì)胞,獲取營養(yǎng)。在玉米黑粉菌的侵染過程中,菌絲的生長主要由信息素及信息素受體系統(tǒng)調(diào)節(jié);而在菌絲生長后,Rbf1基因大量表達(dá)調(diào)控下游基因Biz1、Hap1等,進(jìn)而調(diào)節(jié)附著胞的形成及對植物表皮的穿透,完成整個侵染過程。同時,Rbf1能夠與Clp1、Cib1基因結(jié)合形成復(fù)合物,反饋調(diào)節(jié)信息素的表達(dá),影響菌絲的形成[13]。

      本試驗在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,通過PCR擴增得到T型和MT型菰黑粉菌的Rbf1基因組序列及RNA序列,并對其基本特點進(jìn)行分析,明確其基本結(jié)構(gòu)。同時實驗結(jié)果表明,Rbf1因子的表達(dá)與菰黑粉菌的菌絲生長有一定的關(guān)聯(lián)。無論是T型菰黑粉菌還是MT型菰黑粉菌,在培養(yǎng)初期菌絲形成階段,Rbf1基因一直處于低表達(dá)水平,沒有明顯的變化;菌絲形成后12 h,T型菰黑粉菌與MT型菰黑粉菌中Rbf1因子的表達(dá)量均顯著上調(diào),隨后逐步下降。因此,與玉米黑粉菌類似,菰黑粉菌中Rbf1基因在菌絲的形成及快速生長過程中起著重要作用,可能與玉米黑粉菌類似,參與反饋調(diào)節(jié)信息素的表達(dá)。

      在本實驗的基礎(chǔ)上,后續(xù)可進(jìn)一步篩選可能的與其相互作用的其他基因,同時可通過基因敲除及回補深入研究Rbf1基因在菰黑粉菌菌絲生長及對茭白的侵染作用,為闡明茭白的孕茭機制提供理論基礎(chǔ)。

      [1]Piepenbring M,Stoll M,Oberwinkler F.The generic position ofUstilago maydis,Ustilago scitaminea,andUstilago esculenta (Ustilaginales)[J].Mycological Progress,2002,1 (1):71-80.

      [2]閆寧,徐曉峰,范菁,等.溫室栽培對茭白生長與葉片光合特性的影響[J].長江蔬菜,2011(16):27-30.

      [3]Kawagishi H,Hota K,Masuda K.Osteoclast-Forming suppressive compounds from Makomotake,Zizania latifoliaInfected withUstilago esculenta[J].BiosciBiotechnol Biochem, 2006,70(11):2 800-2 802.

      [4]郭得平,李曙軒,曹小芝.菰黑粉菌某些生物學(xué)特征的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1991,17(1):80-84.

      [5]Zhang J Z,Chu F Q,Guo D P,et al.Cytology and ultrastructure of interactions betweenUstilago esculentaand Zizania latifolia[J].Mycol Progress,2012,11:499-508.

      [6]尤文雨,葉子弘,劉倩,等.我國茭白的生物學(xué)研究[J].長江蔬菜,2008(21):35-38.

      [7]Fujii Y,Usui Y,Konno K,et al.A case of hypersensitivity pneumonitis caused by smut spores ofUstilago esculenta[J]. Japanese Respiratory Society,2007,45(4):344-348.

      [8]Heimel K,Scherer M,Vranes M,et al.The transcription factorRbf1is the master regulator for b-mating type controlled pathogenic development inUstilago maydis[J].PLoS Pathog,2010,6(8):e1001035.

      [9]Vollmeister E,Schipper K,Baumann S,et al.Fungal development of the plant pathogenUstilago maydis[J].FEMS Microbiology Reviews,2012,36(1):59-77.

      [10]李志蘭,尤文雨,鄒克琴,等.菰黑粉菌孢子萌發(fā)過程形態(tài)學(xué)觀察及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].中國計量學(xué)院學(xué)報,2012,21(2):140-145.

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      Cloning and Expression Analysis of Transcription FactorRbf1fromUstilago esculenta

      HU Peng,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
      (College of Life Sciences,China Jiliang University,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,Zhejiang 310018,China)

      For the study ofUstilago esculentamorphological transformation mechanism and formation mechanism of grey Jiaobai,theRbf1gene was cloned in twoU.esculentastrains isolated from white Jiaobai(MT-type)and grey Jiaobai(T-type),based on analysis of the genome and transcriptome sequencing data.Sequence analysis results indicated that the Rbf1gene sequence was conservative in the two strains,with the open reading frame(ORF)of 1 281 bp without intron. The NCBI blast and phylogenetic analysis showed that the Rbf1 had highest homology compared to that inU.maydis.In addition,microscope observation and real-time analysis results showed thatRbf1was up-regulated after the hyphae formed and to be the highest 12 h later,indicating the importance in hyphae formation and growth.

      Ustilago esculenta;Transcription factorRbf1;Hyphae growth

      S645.2;Q781;Q786

      A

      1001-3547(2015)22-0198-04

      10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.072

      浙江省自然科學(xué)基金(LQ15C140003);國家科技支撐計劃項目(2012BAD27B01);國家自然科學(xué)基金項目(3147085)

      胡鵬(1990-),男,碩士,研究方向為植物與微生物互作,E-mail:hpq990@163.com.

      葉子弘,通信作者,電話:0571-86836062,E-mail:zhye@cjlu.edu.cn

      2015-10-14

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