抗衰老Klotho蛋白減輕大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷*

張　軍，代文靜，周敬群△，張家俊，曹志剛(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院ICU科，心血管內(nèi)科，湖北宜昌443000)

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抗衰老Klotho蛋白減輕大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷*

張軍1，代文靜2，周敬群2△，張家俊1，曹志剛1
(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院1ICU科，2心血管內(nèi)科，湖北宜昌443000)

［摘要］目的:觀察抗衰老Klotho蛋白對(duì)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的作用并探討其作用機(jī)制。方法:建立大鼠乳鼠心肌細(xì)胞H/R模型，并將心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照組、H/R模型組和不同濃度(0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L) Klotho作用H/R組。觀察各組心肌細(xì)胞H/R前后搏動(dòng)頻率變化，利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率;測(cè)定各組心肌細(xì)胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡率; real-time PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記及凋亡相關(guān)分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表達(dá)情況; Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，H/R模型組中心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05) ; LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性顯著降低(P＜0.05) ; GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表達(dá)顯著增高(P＜0.05) ; CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)隨之增高而Akt的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。與H/R模型組相比，抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率逐漸降低(P＜0.05)，LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性顯著增高(P＜0.05)，GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表達(dá)逐漸降低(P＜0.05)，CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)也隨之降低，而Akt磷酸化水平顯著增加(P＜0.05)。結(jié)論:抗衰老Klotho蛋白能夠提升H/R損傷后心肌細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞凋亡，通過抵抗氧化應(yīng)激和過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮作用，并與激活A(yù)kt磷酸化有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］Klotho蛋白;缺氧/復(fù)氧;氧化應(yīng)激;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

Anti-aging Klotho protein reduce the hypoxia/reoxygenation injury of neonatal rat myocardial cells

ZHANG Jun1，DAI Wen-jing2，ZHOU Jing-qun2，ZHANG Jia-jun1，CAO Zhi-gang1
(1Department of ICU，2Department of Cardiology，Renhe Hospital，Three Gorges University，Yichang 443000，China.E-mail: zhoujingqun-1@ medmail.com.cn)

［ABSTRACT］AIM: To study the effects of anti-aging Klotho protein on neonatal rat myocardial cells with hypoxia/reoxygenation (H/R) injury.METHODS: The cardiomyocytes of neonatal SD rats were cultured to establish hypoxia/reoxygenation model.The myocardial cells were divided into normal control group，H/R model group，different concentrations of Klotho protein (0.1 μmol/L，1 μmol/L and 10 μmol/L) pretreatment groups.The myocardial cells pulse frequency was observed before and after H/R.The cell viability was measured by MTT assay.The leakages of LDH，CK and AST，the content of MDA and the activity of SOD were detected.The apoptotic rate of the myocardial cells was analyzed by flow cytometry.The mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers and apoptosis-related molecules GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 was measured by real-time PCR.The protein levels of CHOP，caspase-12 and phosphorylated Akt in the myocardial cells were determined by Western blot.RESULTS: Compared with normal control group，the pulse frequency，cell viability rate and SOD activity of myocardial cells were significantly decreased，the cell apoptotic rate as well as the contents of LDH，CK，AST and MDA were increased in H/R model group.The mRNA expressions of GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 as well as the protein levels of CHOP and caspase-12 were increased，whereas p-Akt level was decreased obviously.Compared with H/R model group，the pulse frequency，cell viability rate and SOD activity were increased significantly，the cell apoptotic rate as well as the contents of LDH，CK，AST and MDA were decreased in Klotho pretreated group.The mRNA expression of GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 as well as the protein levels of CHOP andcaspase-12 were decreased，while p-Akt level increased significantly.CONCLUSION: Anti-aging Klotho protein improves the myocardial cell survival and inhibits the apoptosis by increasing the resistance of the cells to oxidative stress and excessive endoplasmic reticulum stress response，which is related with the activation of Akt phosphorylation in H/R-injured mycardial cells.

［KEY WORDS］Klotho protein; Hypoxia/reoxygenation; Oxidative stress; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是指心肌組織缺血一段時(shí)間后再恢復(fù)血流，卻使心肌細(xì)胞損傷加重進(jìn)而影響心肌功能、發(fā)生代謝障礙和心肌超微結(jié)構(gòu)改變，使缺血更為嚴(yán)重和心臟功能惡化的損傷綜合征［1］。I/R發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，對(duì)缺血性心臟病治療影響較大，因此對(duì)I/R損傷病理原因的研究和尋求有效的保護(hù)藥物成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。前期研究表明I/R觸發(fā)的細(xì)胞氧化應(yīng)激刺激和過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)都會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡［2］。心肌缺血損傷是因?yàn)樾募∪毖?、缺營(yíng)養(yǎng)成分造成心肌細(xì)胞壞死或暫時(shí)性功能受損，因此體外培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型是目前主要模擬心肌缺血再灌注的模型之一［3］?？顾ダ螷lotho蛋白是一種與機(jī)體衰老相關(guān)的重要蛋白，可以發(fā)揮抑制機(jī)體衰老、抗氧化、抗凋亡作用，對(duì)心血管、腎等多種器官損傷有抑制作用［4］。心肌缺血疾病多發(fā)于老年人群體，老年人群體心血管疾病術(shù)后I/R損傷的概率更大，但目前針對(duì)抗衰老因素對(duì)I/R損傷相關(guān)性的研究較少見。因此，本研究以SD大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞為研究對(duì)象并建立H/R損傷模型，觀察抗衰老Klotho蛋白對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷的影響，從抗氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面探討其作用機(jī)制，并揭示其與Akt信號(hào)通路的關(guān)系。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

清潔級(jí)SD 1 d內(nèi)大鼠乳鼠由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; Klotho蛋白購自R＆D; DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco;二苯基溴化四氮唑(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma;肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所; Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京鼎國生物公司; RNAiso Plus Reagent試劑盒、Prime ScriptTMRT Reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix ExTaqTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa; CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP )、 caspase-12、Akt和p-Akt抗體購自Abcam; HRP標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京中杉金橋公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)在無菌條件下解剖取出出生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠的心臟組織，用滅菌PBS清洗1遍后，用小剪刀反復(fù)剪碎心臟組織，采用含胰酶和Ⅱ型膠原酶的混合消化液在37℃進(jìn)行消化。將消化好的細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，1 500 r/min離心10 min，棄去上清，用含15%胎牛血清及雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中差速培養(yǎng)1 h后收集未貼壁的細(xì)胞以除去成纖維細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度以5×108/L分別接種于96孔板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。等細(xì)胞基本融合成片后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且同步搏動(dòng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組用純氮N2以1 L/min流速充分飽和不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基30 min后換液并置于缺氧箱中，同樣以1 L/min流速通入含95% N2和5% CO2的混合氣體缺氧培養(yǎng)4 h后更換正常培養(yǎng)基放回正常含95% O2和5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)12 h，構(gòu)建乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R模型。同時(shí)將原代心肌細(xì)胞分為以下組: (1)正常對(duì)照組(control)，即用含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束; (2) H/R組，即缺氧4 h后復(fù)氧培養(yǎng)12 h; (3)不同濃度Klotho+ H/R組，即先將分離心肌細(xì)胞置于含不同濃度(0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L)的Klotho蛋白培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)24 h后，重復(fù)H/R組操作步驟。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的乳鼠原代心肌細(xì)胞接種于96孔板中，并按照上述分組分別處理各組細(xì)胞，選取缺氧前和復(fù)氧后1 h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)在顯微鏡下攝像記錄各組心肌細(xì)胞缺氧前和復(fù)氧后搏動(dòng)頻率。培養(yǎng)結(jié)束后，在每組各孔中加入20 μL 的MTT溶液(5 mg/L)，在37℃下繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150 μL的DMSO，在搖床上作用10 min等結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)590 nm處各孔的吸光度值(A)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。各組心肌細(xì)胞存活率(%)=處理組A590/正常組A590×100%。

2.4 LDH、CK、AST、MDA及SOD的測(cè)定各組心肌細(xì)胞經(jīng)分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞的上清液。按照檢測(cè)試劑盒的說明書步驟，分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中CK、LDH和AST的分泌量。同時(shí)收集各組處理完畢的心肌細(xì)胞，RIPA強(qiáng)裂解液提取細(xì)胞中總蛋白后測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活性變化。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率各組心肌細(xì)胞分組培養(yǎng)結(jié)束后，用含0.25%的胰酶消化離心收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌1遍后重懸細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度為109/L，各組取200 μL細(xì)胞懸液。按照Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作，先各加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻避光室溫孵育20 min，PBS洗滌1次后離心，并用150 μL PBS重懸細(xì)胞。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率變化。

2.6 Real-time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子mRNA表達(dá)根據(jù)GenBank中公布大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、CHOP、caspase-12和β-actin的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物(表1)，并由Invitrogen合成。采用相同的方法分組處理乳鼠心肌細(xì)胞，后消化離心收集各組細(xì)胞。利用TaKaRa RNAiso Plus Reagent試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。利用Bio-Rad公司的IQ5TMreal-time PCR系統(tǒng)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞內(nèi)GRP78、CRT、CHOP、caspase-12 mRNA表達(dá)，并根據(jù)2－ΔΔCt方法對(duì)各基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。

表1　 Real-time PCR引物序列Table 1.The primer sequences of real-time PCR

2.7 Western blot檢測(cè)CHOP、caspase-12、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)離心收集各組處理好的心肌細(xì)胞，PBS洗滌1次后利用RIPA強(qiáng)裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA方法測(cè)定各組細(xì)胞中提取總蛋白的濃度。每組上樣30 μg總蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE 1.5 h，轉(zhuǎn)PVDF膜，用5% BSA封閉30 min后分別孵育CHOP、caspase-12、Akt、p-Akt及內(nèi)參照β-actin I抗(1∶1 000) 4℃過夜，TBST洗滌3次后再分別孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000) 2 h，TBST洗滌3次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光并拍照，利用Quantity One軟件分析各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Klotho蛋白對(duì)H/R前后心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和存活率的影響

H/R模型組中乳鼠原代心肌細(xì)胞復(fù)氧后的搏動(dòng)頻率顯著低于缺氧前(P＜0.05) ;而0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白同時(shí)作用組中原代心肌細(xì)胞復(fù)氧后搏動(dòng)頻率同樣均低于缺氧前狀態(tài)，但顯著高于H/R模型組且具有濃度效應(yīng)(P＜0.05)。同時(shí)MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，H/R模型組中乳鼠原代心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白同時(shí)作用于心肌細(xì)胞，H/R后細(xì)胞的存活率逐漸上升，與單獨(dú)H/R模型組相比有顯著差異(P＜0.05)，見表2。

表2　 Klotho蛋白對(duì)H/R前后心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和存活率的影響Table 2.The effect of Klotho protein on the pulse frequency and survival rate of myocardial before and after H/R (Mean ±SD.n=5)

2 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞LDH、CK和AST漏出量的影響

與正常對(duì)照組相比，H/R模型組培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中LDH、CK和AST的漏出含量均顯著增多(P＜0.05)，說明H/R后心肌細(xì)胞受到明顯損傷。而與H/R模型組相比，0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用組心肌細(xì)胞H/R損傷后LDH、CK和AST的漏出含量均明顯減少(P＜0.05)，并具有一定的濃度效應(yīng)，說明抗衰老Klotho蛋白作用可降低心肌細(xì)胞H/R損傷，見表3。

表3　 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞LDH、CK和AST漏出量，MDA含量及SOD活性的影響Table 3.The effect of Klotho protein on the leakages of LDH，CK and AST，the content of MDA and SOD activity in myocardial cells after H/R (Mean±SD.n=5)

3 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞MDA含量和SOD活性的影響

與正常對(duì)照組相比，H/R模型組心肌細(xì)胞中MDA含量顯著升高，而SOD活性顯著降低(P＜0.05)，說明心肌細(xì)胞H/R后抗氧化能力下降。而當(dāng)0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用后，H/R后原代心肌細(xì)胞中MDA含量逐漸降低，SOD活性則逐漸顯著上升，具有一定濃度效應(yīng)，且與H/R模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

4 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R后細(xì)胞大量凋亡，而抗衰老Klotho蛋白作用能夠降低H/R后細(xì)胞凋亡率，見圖1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，H/R模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。而經(jīng)過不同濃度0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用，各組心肌細(xì)胞H/R后細(xì)胞凋亡率逐漸下降，與H/R模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1.The effect of Klotho protein on the apoptotic rate of myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.圖1 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞凋亡的影響

5 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR可以檢測(cè)抗衰老Klotho蛋白對(duì)乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果見圖2。與正常對(duì)照組相比，H/R模型損傷組心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記分子GRP78和CRT的mRNA表達(dá)均顯著上升(P＜0.05)，而其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)凋亡相關(guān)蛋白CHOP和caspase-12 mRNA表達(dá)也顯著升高(P＜0.05)，說明心肌細(xì)胞H/R損傷誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)不同濃度Klotho蛋白作用心肌細(xì)胞后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表達(dá)均顯著降低并具有明顯濃度效應(yīng)，與單獨(dú)H/R模型損傷組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 2.The effect of Klotho protein on the mRNA expression of endoplasmic reticulum stress related genes in the myocardial cells after H/R by real-time PCR.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.圖2 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

6 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞CHOP、caspase-12、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡蛋白CHOP和caspase-12表達(dá)明顯增加，而抗衰老Klotho蛋白預(yù)作用心肌細(xì)胞后，CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)逐漸降低，見圖3。與正常對(duì)照組相比，H/R模型組中CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.05) ;而不同濃度(0.1、1、10 μmol/L)抗衰老Klotho蛋白作用，各組心肌細(xì)胞H/R后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡蛋白CHOP和caspase-12表達(dá)顯著下降，與H/R模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)對(duì)各組間Akt和p-Akt蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞H/R損傷降低p-Akt的水平，而抗衰老Klotho蛋白作用可以增加心肌細(xì)胞H/R損傷后p-Akt的水平，見圖4。

討論

隨著臨床上越多地開展經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)、體內(nèi)外循環(huán)手術(shù)，心肌組織缺血/再灌注引起的病理損傷問題亦受到更多的關(guān)注［5］。盡管醫(yī)療水平已顯著上升，心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞壞死和凋亡仍導(dǎo)致較高的術(shù)后死亡率［6］。有研究表明缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)是心肌細(xì)胞凋亡的主要誘因［7］。因?yàn)槔夏耆巳后w患心血管疾病的概率較大，冠狀動(dòng)脈硬化導(dǎo)致心肌梗死及術(shù)后缺血再灌注損傷多見于老年患者，提示I/R損傷程度及概率與衰老因素有關(guān)［8］。有研究表明抗衰老Klotho基因在人和小鼠中可通過選擇性剪切拼接產(chǎn)生2種Klotho蛋白產(chǎn)物，一種為膜型Klotho蛋白，主要在腎臟、胎盤、小腸及前列腺中表達(dá);另一種為分泌型Klotho蛋白，以游離形式發(fā)揮作用，在人的多種組織及血清中均能檢測(cè)到存在，而分泌型Klotho蛋白現(xiàn)在已被認(rèn)為是一種抗衰老調(diào)節(jié)激素，對(duì)多種靶器官發(fā)揮重要生理調(diào)節(jié)效應(yīng)，并能夠保護(hù)心血管系統(tǒng)，對(duì)衰老相關(guān)性疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)［9］。最近研究表明，Klotho蛋白與人類心血管疾病、腎等器官損傷修復(fù)都有密不可分的關(guān)系，但關(guān)于其能否在心肌缺血再灌注損傷修復(fù)中發(fā)揮作用尚未見研究［10］。本文中構(gòu)建乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R損傷模型模擬心肌缺血再灌注，研究發(fā)現(xiàn)抗衰老Klotho蛋白作用心肌細(xì)胞H/R損傷后搏動(dòng)頻率和細(xì)胞存活率均顯著增加，明顯高于H/R損傷組并具有濃度效應(yīng)，說明抗衰老Klotho蛋白能夠減輕心肌細(xì)胞H/R后損傷。

Figure 3.The effect of Klotho protein on the expression of CHOP，caspase-12 protein in myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs H/R.圖3 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞CHOP、caspase-12蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of Klotho protein on the protein level of p-Akt in myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.圖4 Klotho蛋白對(duì)H/R后心肌細(xì)胞p-Akt水平的影響

目前有研究認(rèn)為心肌I/R損傷與細(xì)胞中氧自由基大量產(chǎn)生，抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)受損有關(guān)，氧自由基的產(chǎn)生，可使心肌細(xì)胞中過氧化物增多，MDA含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，使心肌細(xì)胞受損而凋亡［11］。心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，代謝功能發(fā)生障礙且細(xì)胞膜受損，當(dāng)復(fù)氧培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷［12］。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的敏感指標(biāo)，其含量多少可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基氧化損傷程度［13］。SOD作為一種抗氧化酶，可以抵抗機(jī)體受氧化損傷，其活性高低也可反映機(jī)體抗體抗氧化能力［14］。本研究中乳鼠原代心肌細(xì)胞H/R損傷后MDA含量顯著上升而SOD活性顯著下降，說明心肌細(xì)胞H/R損傷后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)也受到影響而抗氧化能力嚴(yán)重下降。當(dāng)不同濃度抗衰老Klotho蛋白預(yù)作用于心肌細(xì)胞，H/R損傷后細(xì)胞中MDA含量逐漸下降，而SOD活性逐漸上升，說明Klotho蛋白能夠刺激心肌細(xì)胞的抗氧化抵抗系統(tǒng)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除以減輕H/R損傷，從而對(duì)受H/R損傷的心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。而心肌細(xì)胞中CK、LDH及AST漏出量也可作為心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo)，LDH、CK和AST都是心肌細(xì)胞的胞內(nèi)酶，其漏出量多少能直接反映細(xì)胞功能變化和細(xì)胞膜的受損程度［15］。本研究中原代心肌細(xì)胞H/R損傷后發(fā)現(xiàn)LDH、CK及AST漏出量均顯著增加，說明H/R能嚴(yán)重?fù)p傷心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和功能。當(dāng)不同濃度抗衰老Klotho蛋白預(yù)作用H/R損傷心肌細(xì)胞后，LDH、CK和AST漏出量均顯著降低，遠(yuǎn)低于單獨(dú)H/R模型組，說明Klotho蛋白能維持H/R損傷后心肌細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指當(dāng)細(xì)胞處于內(nèi)外不利因素時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致發(fā)生大量錯(cuò)誤或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，激活相應(yīng)信號(hào)通路引起細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，其參與細(xì)胞凋亡過程，與各種病理生理反應(yīng)如心肌缺血再灌注損傷、毒理、病理反應(yīng)均有關(guān)［16］。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)活性氧自由基應(yīng)激因素非常敏感，心肌細(xì)胞大量活性氧自由基產(chǎn)生時(shí)可直接導(dǎo)取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，激發(fā)ERS反應(yīng)，因此ERS反應(yīng)參與到心肌細(xì)胞I/R損傷的病理過程中［17］。ERS是細(xì)胞內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制之一，但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能從而激活細(xì)胞凋亡通路使細(xì)胞發(fā)生凋亡［18］。GRP78和CRT都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵分子伴侶，在ERS激活過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)上調(diào)標(biāo)志ERS的激活［19］。Millott等［20］研究也發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注能夠激活ERS中GRT78和CRT表達(dá)增加。本研究中利用real-time PCR檢測(cè)原代心肌細(xì)胞H/R后同樣發(fā)現(xiàn)GRT78和CRT的mRNA表達(dá)顯著上升，說明H/R損傷與大量ERS反應(yīng)有關(guān)。而當(dāng)抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌細(xì)胞后，GRT78和CRT的mRNA表達(dá)雖然仍高于正常對(duì)照組，但已逐漸低于H/R模型組，說明Klotho蛋白能夠減輕心肌細(xì)胞內(nèi)ERS反應(yīng)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡與CHOP和caspase-12有關(guān)，CHOP表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所特有半胱氨酸蛋白酶caspase-12的激活都能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序［21］。CHOP是轉(zhuǎn)錄因子家族C/EBP成員，在正常生理狀況下表達(dá)極低，而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)其表達(dá)顯著被誘導(dǎo)并參與下游細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)［22］。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的組成蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)能經(jīng)過特定位點(diǎn)的剪切激活誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此，caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子［23］。本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H/R后心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而凋亡率顯著上升，同時(shí)利用real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)原代心肌細(xì)胞H/R后CHOP和caspase-12 mRNA表達(dá)均顯著升高，而Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)正常心肌細(xì)胞中CHOP和 caspase-12蛋白表達(dá)較低，而H/R后CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)卻顯著上升與其mRNA表達(dá)具有一致性，再次說明心肌細(xì)胞H/R損傷激活CHOP 和caspase-12引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)不同濃度抗衰老Klotho蛋白作用心肌細(xì)胞H/R后，細(xì)胞凋亡率卻均顯著下降，而CHOP、caspase-12 mRNA和蛋白表達(dá)隨之逐漸降低，說明Klotho蛋白通過降低CHOP和caspase-12表達(dá)，抑制H/R誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Akt信號(hào)途徑在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)Akt磷酸化后被激活并參與細(xì)胞遷移、侵襲、促進(jìn)血管修復(fù)和生成并抑制細(xì)胞凋亡過程［24］。前期研究表明Akt磷酸化增加能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，對(duì)缺血性心臟疾病治療具有重要作用［25］。而有研究報(bào)道，抗衰老蛋白Klotho發(fā)揮抗氧化作用，并參與心血管等組織的損傷修復(fù)與Akt信號(hào)途徑活化有關(guān)［26］。本研究利用Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞H/R前后Akt和p-Akt水平的變化，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞H/R前后Akt總量無明顯變化，但p-Akt水平顯著下降，說明H/R損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡與Akt磷酸化水平降低有關(guān)。當(dāng)高濃度Klotho蛋白作用于心肌細(xì)胞，H/R損傷后細(xì)胞中p-Akt/Akt比值顯著增加，說明Klotho蛋白能夠刺激心肌細(xì)胞中Akt磷酸化水平，抑制H/R損傷造成的細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。而另有研究表明，F(xiàn)GF信號(hào)通路可通過低血壓效應(yīng)減少缺血、缺氧再灌注對(duì)組織的損傷，Klotho蛋白可以作為輔助因子與FGF23受體(FGF23 receptor，F(xiàn)GFR)結(jié)合，增強(qiáng)FGFR和FGF23的親和力，通過FGF23/Klotho-FGFR途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［27］。因此，抗衰老Klotho蛋白保護(hù)H/R損傷后的心肌細(xì)胞具體的分子機(jī)制有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，抗衰老Klotho蛋白能夠提升心肌細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡，通過抵抗氧化應(yīng)激和過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用，并與激活A(yù)kt磷酸化有關(guān)。

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［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.004

通訊作者△Tel: 0717-6555730; E-mail: zhoujingqun-1@ medmail.com.cn

*［基金項(xiàng)目］湖北省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.D20091308)

［收稿日期］2014-12-25
［修回日期］2015-01-12

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-0980-08