童春容

血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在血液腫瘤診治中的應(yīng)用及展望

童春容

作者單位:101601北京市，北京道培醫(yī)院血液科

血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)從早期經(jīng)典的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色方法，到后來的組織病理學(xué)檢驗(yàn)和免疫學(xué)分析，再到細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)分析、分子生物學(xué)分析，進(jìn)而對血液腫瘤的認(rèn)識從細(xì)胞形態(tài)上升到遺傳和基因水平，對血液腫瘤的類型也有了更準(zhǔn)確和更細(xì)致的劃分。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，不同的檢測技術(shù)適用于不同血液腫瘤的診治，而多種技術(shù)聯(lián)合檢測也能夠提高診斷血液腫瘤的準(zhǔn)確性，為臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對血液腫瘤患者的診治和預(yù)后評估有著重要意義。

血液學(xué)檢驗(yàn)；血液腫瘤；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；細(xì)胞遺傳學(xué)；分子遺傳學(xué)；基因測序；基因芯片技術(shù)；融合基因檢測

上世紀(jì)80年代中期以前，對血液腫瘤的檢測主要根據(jù)光鏡及電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞化學(xué)染色、組織病理學(xué)檢查及臨床表現(xiàn)形式將其分為白血病、淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性疾病等。自1966年來，組織病理學(xué)檢查聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）成為淋巴瘤診斷與分型的金標(biāo)準(zhǔn)。1976年開始，法國、美國、英國三國專家組成的急性白血病（acute leukemia，AL）診斷與分型協(xié)作組主要依據(jù)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞化學(xué)染色最早提出了AL的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型意見，此后又進(jìn)行了多次修改補(bǔ)充，同時對MDS也提出了診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)。

隨著免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展與臨床應(yīng)用，綜合多種技術(shù)方法對血液腫瘤進(jìn)行診斷和分型的一致性、重復(fù)性更好、更客觀，且更能反映疾病亞型的生物學(xué)及臨床特征，能更好地幫助判斷預(yù)后，指導(dǎo)制訂治療方案及路線、監(jiān)測療效，甚至有助于對疾病發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制更深入的了解，幫助開發(fā)新的治療方法。自1995年開始，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）召集歐洲血液病理協(xié)會、國際血液病理協(xié)會、國際血液學(xué)及腫瘤學(xué)臨床專家成立了WHO造血淋巴系統(tǒng)腫瘤診斷與分型指導(dǎo)委員會，提出了血液腫瘤的統(tǒng)一診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)。之后曾多次修訂，最近一次修訂為2008年［1］。另外，WHO在2011年-2014年對骨髓增殖性腫瘤 （myeloproliterative neoplasms， MPN）的診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)提出了修改意見，并對部分淋巴系統(tǒng)腫瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂［2-6］；國際MDS預(yù)后工作組于2012年提出了修改的MDS預(yù)后積分系統(tǒng)［7］。

國際上一些大的協(xié)作組也在WHO基礎(chǔ)上提出一些修改的或更細(xì)化的血液腫瘤診治指南，如美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)2015年版，歐洲白血病網(wǎng)指南2013年版等。我國也在近年來對血液腫瘤診治指南進(jìn)行了制定和修訂，如中國抗癌協(xié)會造血/淋巴系統(tǒng)腫瘤專業(yè)委員于2014年提出的《中國B細(xì)胞慢性淋巴增殖性疾病診斷專家共識（2014年版）》［8］、中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會實(shí)驗(yàn)診斷血液學(xué)學(xué)組于2014年提出的 《中國慢性髓性白血病診療監(jiān)測規(guī)范（2014年版）》［9］。血液腫瘤的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)發(fā)展很快，如果檢驗(yàn)醫(yī)生及臨床醫(yī)師知識不能及時更新，可能導(dǎo)致同一患者的標(biāo)本在不同醫(yī)院常常得到不同的診斷結(jié)論。國際上發(fā)達(dá)國家誕生了血液病理醫(yī)師，整合臨床各方面信息及腫瘤的形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、IHC、流式細(xì)胞分析（flow cytometry，F(xiàn)CM）、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)，甚至病原學(xué)結(jié)果，做出整合診斷報告。血液腫瘤進(jìn)入了整合診斷時代已經(jīng)是不爭的事實(shí)。如何應(yīng)用這些實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)，以期得到更好的診斷結(jié)果，是每位檢驗(yàn)醫(yī)生應(yīng)當(dāng)思考的。本文就目前臨床上常用的血液腫瘤檢驗(yàn)診斷技術(shù)進(jìn)行簡要介紹，為檢驗(yàn)醫(yī)生和臨床醫(yī)師提供參考。

1　細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)是對血涂片、骨髓穿刺液涂片、其他部位細(xì)胞涂片或組織印片進(jìn)行染色后在光鏡下觀察形態(tài)。多種細(xì)胞化學(xué)染色反應(yīng)也可幫助鑒別不同系列來源或不同成熟階段的細(xì)胞［10］。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色是血液腫瘤診斷與分型的基礎(chǔ)方法，易于在基層單位推廣。無論新技術(shù)如何發(fā)展，這一方法仍有不可替代的價值。由于細(xì)胞涂片一般是骨髓穿刺第一針抽取的標(biāo)本，各種組織印片、體液細(xì)胞均可以制備成細(xì)胞涂片觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞化學(xué)染色，取材方便。細(xì)胞涂片很少稀釋，幾乎未處理，或?qū)?biāo)本處理很少，細(xì)胞一般很少變形，因此判斷血液腫瘤細(xì)胞的比例更準(zhǔn)確；在標(biāo)本量很少的情況下，對形態(tài)觀察要求高的MDS，一些少見的、大的惡性細(xì)胞的確定優(yōu)于其他方法［11］。細(xì)胞化學(xué)染色簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、直觀，染色一般10-30 min完成，因此細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)往往是可在較短時間內(nèi)報告結(jié)果的方法，可為其他檢測做出提示。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色診斷除了需要檢驗(yàn)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)外，還依賴良好的染色技術(shù)及高分辨率的光學(xué)顯微鏡。計(jì)算機(jī)及圖像分析軟件目前可以讓檢驗(yàn)醫(yī)生更方便地打印出帶圖像的報告，但因尚不能自動辨認(rèn)細(xì)胞，仍需人工辨別，這就需要檢驗(yàn)醫(yī)生有豐富的細(xì)胞形態(tài)學(xué)知識和經(jīng)驗(yàn)。隨著大數(shù)據(jù)電子信息化及圖像分析軟件的智能化，相信細(xì)胞形態(tài)學(xué)報告對檢驗(yàn)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的依賴會有所下降。

2　組織病理學(xué)檢查

組織病理學(xué)檢查是通過對各種組織活檢標(biāo)本，包括骨髓活檢組織標(biāo)本進(jìn)行固定、處理、切片、染色后在光鏡下觀察做出診斷。

活檢的組織標(biāo)本取出后一般立即放入固定液直接固定，不容易損失細(xì)胞信息，因此惡性細(xì)胞的比例更準(zhǔn)確客觀，而且可以直接觀察到組織結(jié)構(gòu)，容易確定惡性細(xì)胞在組織的定位，對一些有特殊形態(tài)或結(jié)構(gòu)改變的淋巴瘤診斷意義較大［2］。組織病理學(xué)檢查觀察的范圍比抽取骨髓血進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色檢查的范圍大，尤其對一些抽不出細(xì)胞的組織，或少見細(xì)胞、體積很大的細(xì)胞仍可診斷，如骨髓纖維化、漿細(xì)胞腫瘤、淋巴瘤、轉(zhuǎn)移癌、組織細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、霍奇金細(xì)胞等，因此該方法也是診斷實(shí)體腫瘤最重要的方法［3］。在我國，腫瘤醫(yī)院或綜合醫(yī)院腫瘤科醫(yī)生較重視組織病理診斷，而血液科醫(yī)生往往更重視抽取骨髓血涂片的形態(tài)、免疫分型核型分析、染色體、基因檢查，容易忽視對骨髓組織活檢的病理學(xué)檢查，導(dǎo)致對伴骨髓纖維化的血液腫瘤、MDS尤其容易漏診或誤診。

3　免疫學(xué)分析

免疫學(xué)分析主要包括IHC和FCM。采用不同染料或熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體對細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片或骨髓組織切片進(jìn)行染色，然后在流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或光鏡下觀察細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原標(biāo)記，對血液腫瘤進(jìn)行免疫分型。

3.1IHCIHC一般用染料或熒光染料標(biāo)記的抗體對組織病理切片的組織進(jìn)行細(xì)胞染色，抗體與抗原結(jié)合后標(biāo)記的染料顯色，可在光鏡下觀察著色反應(yīng)；或熒光素發(fā)出熒光，可在熒光顯微鏡下觀察熒光反應(yīng)，從而了解細(xì)胞表達(dá)的免疫標(biāo)記，是目前病理檢查最廣泛應(yīng)用的方法，一般與組織病理普通染色同時進(jìn)行［5］。病理組織標(biāo)本具有組織病理學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行IHC，比FCM更容易確定某一免疫標(biāo)記陽性或陰性細(xì)胞在組織部位的定位，對一些抽不出的細(xì)胞、少見細(xì)胞、體積很大的細(xì)胞，仍可診斷，一些免疫標(biāo)記用IHC檢測比FCM更準(zhǔn)確，如細(xì)胞周期蛋白D1。

IHC的發(fā)展依賴于可用于組織病理切片染色的單抗、標(biāo)記單抗的可顯色染料、顯微鏡的分辨能力，還有大數(shù)據(jù)電子信息化及圖像分析軟件的智能化等技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展。相信隨著這些技術(shù)的不斷發(fā)展，組織病理學(xué)檢查及IHC診斷對病理醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的依賴會有所下降。

3.2FCMFCM是將標(biāo)本制備成單個細(xì)胞懸液，然后用熒光染料標(biāo)記單抗細(xì)胞，再用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀可以探測單個細(xì)胞的大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒的多少及標(biāo)記在細(xì)胞上的熒光光譜，并將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，用計(jì)算機(jī)存儲下來，再用分析軟件分析。

流式細(xì)胞儀除了直接探測細(xì)胞的大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒的多少外，還可一次性檢測同一個細(xì)胞上3～10種以上免疫標(biāo)記是否表達(dá)、表達(dá)強(qiáng)度、不同免疫標(biāo)記之間的關(guān)系。如果含有不同細(xì)胞群的標(biāo)本在同一試管染不同熒光標(biāo)記的抗體，可以劃出有同樣熒光標(biāo)記的一群細(xì)胞所在區(qū)域（設(shè)門），分析和計(jì)算該細(xì)胞群的特征和數(shù)量。FCM可以在幾個小時內(nèi)完成對同一患者幾十萬個細(xì)胞上數(shù)百種免疫標(biāo)記的分析，與IHC相比更為快速、簡便，一致性及重復(fù)性更好。

雖然血液腫瘤細(xì)胞上的單個免疫標(biāo)記與正常細(xì)胞差異很小，但是綜合多種免疫標(biāo)記的分析，與正常細(xì)胞相比，大多數(shù)的惡性血液細(xì)胞具有一些異常表達(dá)的現(xiàn)象，可幫助判斷細(xì)胞的良惡性，與細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)和IHC相比，F(xiàn)CM能更好地判斷細(xì)胞的良惡性，在此基礎(chǔ)上，更容易判斷惡性細(xì)胞的系列來源及成熟階段。因?yàn)楹芏嗝庖邩?biāo)記在正常細(xì)胞上也存在，因此進(jìn)行血液腫瘤免疫分型時應(yīng)該確定免疫標(biāo)記在血液腫瘤細(xì)胞表面，而不是簡單地根據(jù)某一免疫標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量來判斷。尤其是當(dāng)組織中存在大量的正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞比例很低時，或有正常早期免疫標(biāo)記的細(xì)胞反應(yīng)性增加時，單純用IHC判斷腫瘤細(xì)胞的系列來源及分化階段可能造成誤診。很多免疫表型復(fù)雜的血液腫瘤幾乎只能用FCM來診斷，而不能用IHC診斷，尤其是同一患者存在多種惡性血液腫瘤克隆，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、髓細(xì)胞共存，淋巴瘤和AL共存，甚至有血液腫瘤和其他系統(tǒng)腫瘤共存的現(xiàn)象。FCM還可以對一些轉(zhuǎn)移癌等非造血系統(tǒng)腫瘤做出提示性診斷。由于FCM檢查的細(xì)胞數(shù)量多，分析的免疫標(biāo)記多，F(xiàn)CM可以檢查很微量的血液腫瘤細(xì)胞，敏感性可達(dá)10-3～10-4；且覆蓋面廣，對80%以上的血液腫瘤細(xì)胞都可用FCM檢測，因此FCM是監(jiān)測治療后微小腫瘤殘留病（minimal residual disease，MRD）最常用的方法［12］。

血液腫瘤細(xì)胞上的一些分化抗原決定簇，如CD20、CD52、CD19、CD30等，已經(jīng)有單抗、嵌合性受體基因轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞等有效治療方法，檢測這些免疫標(biāo)記可幫助選擇靶向治療。靶向治療后，腫瘤細(xì)胞上的這些抗原還有可能丟失，因此監(jiān)測這些抗原的變化可指導(dǎo)更精確的靶向治療。有些免疫標(biāo)記代表血液腫瘤的預(yù)后不好，如急性混合細(xì)胞性白血病。

FCM可檢測多種標(biāo)本，如血液、骨髓、活檢組織、各種細(xì)針或粗針穿刺標(biāo)本、胸水、腹水、腦脊液等多種體液，因此容易檢測血液腫瘤在其他部位的浸潤。

FCM診斷的準(zhǔn)確性與標(biāo)本處理方式、儀器校準(zhǔn)、檢測抗體的選擇、抗體組合、目標(biāo)細(xì)胞的設(shè)門、抗原表達(dá)比例及強(qiáng)度的判斷，檢驗(yàn)醫(yī)生的相關(guān)專業(yè)知識水平和經(jīng)驗(yàn)等因素有關(guān)。目前國內(nèi)外不同機(jī)構(gòu)的檢測結(jié)果尚不易互認(rèn)，尤其對血液腫瘤細(xì)胞比例很小的MRD監(jiān)測，差異及分歧很大。國際上一些協(xié)作組監(jiān)測MRD時，一般僅選擇1～3個實(shí)驗(yàn)室來報告。為了減少不同實(shí)驗(yàn)室之間的報告誤差，國際上先后出臺了一些FCM診斷血液腫瘤的專家共識［4-6］。

FCM的發(fā)展依賴單抗、熒光染料、流式細(xì)胞儀、計(jì)算機(jī)分析能力、多參數(shù)（包括熒光顏色）分析軟件等技術(shù)的發(fā)展。近10多年來，以上技術(shù)都有飛速的發(fā)展，導(dǎo)致越來越多的血液腫瘤被鑒別。其中單抗從2001年的166種增加到2008年的350種，標(biāo)記單抗的熒光染料也明顯增加，目前已經(jīng)有10多種可以應(yīng)用的熒光染料。流式細(xì)胞儀性能的增加，比如探測熒光光譜的激光增加，分辨不同光譜的能力增加。計(jì)算機(jī)大數(shù)據(jù)分析能力增加及分析軟件的改善，可以多維的同時分析細(xì)胞上的全部參數(shù)（包括細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒及標(biāo)記的熒光參數(shù)），這樣可使FCM診斷減少對檢驗(yàn)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)和知識的依賴。

4　細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)分析

細(xì)胞遺傳學(xué)主要采用染色體核型分析，分子遺傳學(xué)分析主要采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)。

4.1細(xì)胞遺傳學(xué)分析染色體存在于細(xì)胞核中，在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂且在分裂中期時，染色體高度濃縮呈現(xiàn)可見的形態(tài)，經(jīng)體外處理出現(xiàn)不同的條帶，在光學(xué)顯微鏡下可分析。染色體及基因異常在血液腫瘤的診斷、預(yù)后分層中起到越來越重要的作用。

很多血液腫瘤細(xì)胞具有染色體異常，一些染色體異常在多個患者中發(fā)現(xiàn)，具有一些共同的臨床及血液學(xué)特征，稱為重現(xiàn)性染色體異常，具有獨(dú)立的預(yù)后評估及指導(dǎo)臨床治療的價值。對一些患者具有重要的診療價值，如有復(fù)雜染色體異常，-5、-7等染色體異常的急性髓細(xì)胞性白血病 （acute myelocytic leukemia，AML）預(yù)后很差，需要盡快進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植。t（15；17）（q22；q12）染色體異常僅見于急性早幼粒細(xì)胞性白血病，對全反式維甲酸、砷劑及蒽環(huán)（醌）類藥物治療的療效好，其治愈率可達(dá)90%以上。對上述患者來說，應(yīng)用染色體核型分析及早診斷，對患者的治療和預(yù)后評估都有極大的幫助。一般來說，診斷AL需要骨髓和/或外周血中原始細(xì)胞≥20%才能診斷，在WHO（2008）標(biāo)準(zhǔn)中，當(dāng)證實(shí)有一些重現(xiàn)性染色體易位或由此引起的融合基因時，即使原始細(xì)胞＜20%也可診斷AML。

與FISH技術(shù)比較，染色體核型分析反映了全基因組的遺傳學(xué)改變，可同時發(fā)現(xiàn)多種染色體異常，與其他基因分析技術(shù)比較，對整條染色體或較大片段染色體（數(shù)百萬堿基以上的片段）的丟失或增加或易位的發(fā)現(xiàn)更直觀、快速、便捷。

染色體核型分析準(zhǔn)確率的提高依賴于核型制備方法的改善，使腫瘤細(xì)胞分裂以便有可供分析的染色體核型以及顯微鏡分辨率的提高，而計(jì)算機(jī)及分析軟件的智能化則極大地提高了染色體核型分析的工作效率。目前染色體核型掃描系統(tǒng)及分析軟件可明顯縮短檢驗(yàn)醫(yī)生尋找染色體核型的時間，研究人員也在研究用FCM分辨染色體，但迄今為止尚不能完全代替人工分辨。隨著計(jì)算機(jī)大數(shù)據(jù)、圖像分析能力、及人工智能化程度的增加，可能進(jìn)一步減少對檢驗(yàn)醫(yī)生檢測時間的耗費(fèi)和經(jīng)驗(yàn)的依賴。

4.2分子遺傳學(xué)分析技術(shù)分子遺傳學(xué)分析技術(shù)主要為FISH，F(xiàn)ISH采用熒光標(biāo)記不同染色體或基因片段的探針，和染色體或細(xì)胞的基因雜交后，在熒光顯微鏡下分析熒光信號，從而判斷染色體或基因的異常。

與染色體核型分析比較，F(xiàn)ISH可以檢測染色體變化很微小的異常，可以檢測不分裂的細(xì)胞，分析的細(xì)胞數(shù)目明顯比染色體核型分析多，一般可分析500個以上的細(xì)胞，而染色體核型分析一般僅能分析20個細(xì)胞，因此大大增加了染色體分析的敏感性和準(zhǔn)確性，對于已知的染色體/基因異常，可用FISH監(jiān)測治療后的MRD。與其他基因檢測技術(shù)比較，F(xiàn)ISH更容易檢查基因發(fā)生的多種易位、染色體內(nèi)基因擴(kuò)增、大片段基因丟失等［13］。FISH檢測需要的標(biāo)本量較少，染色體滴片、細(xì)胞涂片、組織印片，甚至既往室溫保存的骨髓、血液涂片，石蠟切片均可用于FISH檢測。如果選用的探針質(zhì)量好，染色技術(shù)好，F(xiàn)ISH診斷對檢驗(yàn)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)要求比染色體核型分析低一些。對于檢驗(yàn)醫(yī)生肉眼難以辨認(rèn)的染色體異常，如果可估計(jì)可疑的染色體號或條帶，可用相應(yīng)的探針及FISH確定。腫瘤細(xì)胞不易分裂從而產(chǎn)生假陰性染色體結(jié)果，因此，檢驗(yàn)醫(yī)生常常把與這些疾病相關(guān)的有診斷、預(yù)后評估和指導(dǎo)臨床治療價值的探針組合，形成FISH套餐，給臨床醫(yī)生更好的指導(dǎo)。和其他基因檢測技術(shù)比較，F(xiàn)ISH使用的探針范圍比較大，對一些容易發(fā)生與多種伙伴基因易位形成多種融合基因的異常，染色體內(nèi)大范圍基因的擴(kuò)增、重復(fù)，F(xiàn)ISH技術(shù)比基因分析更為直觀、簡單、便捷。如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生C-MYC擴(kuò)增或易位，或同時伴有BCL-2和/或BCL-6擴(kuò)增或易位，則預(yù)后很差，用一線治療方案療效差，用FISH技術(shù)能夠更準(zhǔn)確的檢測出這種擴(kuò)增或異位，指導(dǎo)臨床治療。再比如，MLL、PDGFRB、ABL基因易位至很多部位與不同基因易位形成融合基因，這些基因易位預(yù)后差，一般需要移植，酪氨酸激酶抑制劑對PDGFRB基因、ABL基因易位的血液腫瘤療效較好。FISH技術(shù)很容易判斷這些基因是否發(fā)生了易位，且不容易漏診或誤診。

FISH技術(shù)的發(fā)展需要開發(fā)更多可用于臨床診斷的探針，多色熒光顯微鏡，以及大數(shù)據(jù)分析和更加智能化的軟件分析系統(tǒng)，使檢驗(yàn)醫(yī)生可以用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的染色體或基因異常。

5　基因分析

血液腫瘤是由于造血干/祖或前體細(xì)胞染色體異?；蚧蛲蛔儯瑢?dǎo)致細(xì)胞增殖、分化或凋亡異常，惡性血液細(xì)胞大量增加的疾病。造血細(xì)胞的基因突變可以是點(diǎn)突變、基因片段丟失或增加或重復(fù)擴(kuò)增，也可以是染色體易位等異常形成新的融合基因。兩條染色體斷裂，原本不相干的斷端連接在一起，形成染色體易位。染色體易位通過干擾、去除或代替臨近的基因?qū)е略┗蚣せ睢⒁职┗驕缁?，或融合基因產(chǎn)生某種功能的融合蛋白。干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化過程中，T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）和免疫球蛋白重鏈IgH基因的可變區(qū)（V）和結(jié)合區(qū)（J）基因會發(fā)生重排，即兩個距離很遠(yuǎn)的片段重新排列在一起，形成新片段。每個淋巴細(xì)胞都有各自序列不同的TCR或IgH片段，淋巴細(xì)胞腫瘤增殖呈單克隆性，如果檢測出一種基因重排片段明顯升高，可考慮有單克隆淋巴細(xì)胞增生。因此IgH及TCR基因重排分析技術(shù)可幫助鑒別淋巴細(xì)胞是否為單克隆性增生。目前臨床應(yīng)用的基因檢測技術(shù)主要有融合基因檢測、基因測序和基因芯片技術(shù)。

5.1融合基因檢測染色體斷裂，使不同部位的兩段基因融合在一起，形成血液腫瘤特有的融合基因。檢查和治療后定量監(jiān)測這些融合基因有非常重要的臨床意義。

血液腫瘤重現(xiàn)性融合基因異常與其相應(yīng)的染色體異常具有相同的臨床意義，包括疾病的診斷、預(yù)后評估和指導(dǎo)治療。檢測融合基因主要采用聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。有時染色體斷裂易位的片段很小，用普通染色體核型分析方法檢測不出來，但是可以用FISH或PCR檢測出相應(yīng)的融合基因，稱為隱匿性染色體易位，這些融合基因具有與該染色體易位相同的價值。如患者具有慢性髓細(xì)胞性白血病的臨床及血液學(xué)特征，染色體正常，但有BCR-ABL融合基因，仍可診斷為慢性髓細(xì)胞性白血病，因?yàn)檫@類患者仍然可用格列衛(wèi)等治療后緩解。融合基因可用定量PCR技術(shù)定量監(jiān)測MRD，迄今為止，熒光標(biāo)記探針的實(shí)時定量PCR技術(shù)監(jiān)測融合基因拷貝數(shù)是最敏感的監(jiān)測白血病MRD的方法，具有很好的預(yù)后評估及指導(dǎo)治療的意義。

目前檢測白血病特有的融合基因應(yīng)用最多的仍是PCR和熒光標(biāo)記實(shí)時定量PCR技術(shù)，這也是臨床分子生物學(xué)的主要診斷技術(shù)。臨床上先進(jìn)行數(shù)十種融合基因、上百種變異體的篩查，再對陽性的融合基因定量，已被廣泛認(rèn)可為血液腫瘤融合基因診斷首選的檢測方案［13］。

近年來PCR技術(shù)較為顯著的改進(jìn)是快速且超保真的DNA聚合酶（Phusion、Q5等）、快速PCR儀（xxpress定量PCR儀等），以及數(shù)字PCR技術(shù)。如Phusion聚合酶具有50倍于普通Taq酶的保真性，對于需要較高靈敏度的基因突變檢測有益。Phusion聚合酶還具有超強(qiáng)的抗雜質(zhì)干擾能力，更容易保證微量或復(fù)雜標(biāo)本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。聯(lián)合快速聚合酶和快速PCR儀可使PCR擴(kuò)增過程從原來的2 h左右縮短為十幾分鐘，可以顯著縮短檢測周期和臨床報告時間。數(shù)字PCR技術(shù)本質(zhì)上是對同一份標(biāo)本和擴(kuò)增目標(biāo)同時進(jìn)行很多個微量的PCR檢測，尤其有利于高靈敏度點(diǎn)突變檢測和精確的拷貝數(shù)分析。但由于檢測通量和成本的限制，目前階段還難以成為臨床常規(guī)應(yīng)用的檢測技術(shù)。

5.2基因測序基因大片段丟失或擴(kuò)增（數(shù)百萬堿基以上的片段變化）可用染色體核型分析或FISH檢測；檢測數(shù)百萬堿基以下的片段變化可用基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因片段拷貝數(shù)變異（copy number variant，CNV）分析，又稱為CNV芯片技術(shù)。但是對數(shù)百個堿基長度以下的片段變化，尤其是基因堿基點(diǎn)突變需要用基因測序技術(shù)。隨著基因檢測技術(shù)在臨床及研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)基因突變對血液腫瘤的診斷具有重要的臨床意義，而這又促進(jìn)了基因檢測技術(shù)的發(fā)展。

基因測序是檢測突變的最常用方法，可以檢測目的基因的全部突變類型，與既往的方法比較，提高了基因突變的檢出率?；驕y序可以用骨髓/血涂片、組織切片、組織印片等少量標(biāo)本做幾十種甚至上百種基因突變篩查。

基因突變檢測對血液腫瘤有輔助診斷的作用，尤其是對MPN、MDS、MDS/MPN綜合征等沒有特異性的免疫分型、染色體核型或融合基因異常的血液腫瘤，在早期時難以與再生障礙性貧血、類白血病等非腫瘤疾病鑒別。幾乎所有的血液腫瘤都能檢查到某種或多種基因突變，因此當(dāng)患者具有臨床表現(xiàn)及一些實(shí)驗(yàn)室特征時，相關(guān)基因突變陽性對這些疾病的診斷有重要意義。例如JAK2基因突變可見于多種MPN及其他血液腫瘤。需要注意的是，一些健康人也可能查出某種基因突變，如果沒有臨床、血液學(xué)及其他異常表現(xiàn)，則不能診斷血液腫瘤。

基因突變對AML、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、MDS、MPN、MDS/MPN等多種血液腫瘤都有預(yù)后評估作用，越來越多的基因突變被納入危險分層方案中。基因突變的檢測還可幫助選擇靶向藥物或其他藥物，如FLT3-ITD突變陽性的AML患者可用索拉菲尼、蘇坦等靶向藥物治療暫時獲得完全緩解或部分緩解，為移植創(chuàng)造有利條件；有KIT基因突變者用格列衛(wèi)等酪氨酸激酶抑制劑治療有較好的療效；表觀基因突變者可用甲基化抑制劑（氮雜胞苷、地西他濱）及組蛋白去乙?；敢种苿┲委煟瑢Σ糠諱DS、AML有效，尤其是TET2基因突變者用氮雜胞苷療效較好等。一些血液腫瘤采用靶向藥物治療后可能發(fā)生耐藥性基因突變，檢測耐藥基因突變可指導(dǎo)臨床調(diào)整靶向藥物，如BCR-ABL陽性的血液腫瘤，采用一代酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥后，可根據(jù)ABL激酶區(qū)突變的類型選擇第二代或第三代靶向藥物?；蛲蛔兊念愋图安课灰才c選擇靶向藥物有關(guān)。如粒細(xì)胞集落刺激因子3受體突變主要見于慢性中性粒細(xì)胞白血病，如果在近膜區(qū)突變（主要為T618I、T615A）對JAK抑制劑敏感，如果是胞漿內(nèi)尾區(qū)的突變（截短型突變）則對達(dá)沙替尼敏感。

基因突變檢測為了解血液腫瘤的發(fā)病原因及機(jī)制提供了新的證據(jù)。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為，引起血液腫瘤的大多數(shù)基因突變是后天獲得的，約5%的AL與遺傳有關(guān)。近年來，隨著基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)血液腫瘤患者有遺傳易感基因的可能明顯高于既往報告的結(jié)果。

根據(jù)目前深度基因測序結(jié)果，每個血液腫瘤患者都可檢測出多種基因突變，中位突變數(shù)達(dá)10多個，一個患者最多可有50多個基因突變，一些基因突變存在于幾乎全部血液腫瘤細(xì)胞中，是基礎(chǔ)基因突變，一些為驅(qū)動基因突變，一些是伴隨基因突變。同一患者的血液腫瘤細(xì)胞可有不同基因突變的克隆，一些是主要克隆，一些是小克隆，還有一些為腫瘤前期克隆。治療緩解后，主要克隆消失，腫瘤前期克隆持續(xù)存在，如果各種因素導(dǎo)致腫瘤前期克隆獲得新的基因突變，細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢、失去分化成熟或凋亡的能力，則導(dǎo)致血液腫瘤復(fù)發(fā)；或治療前耐藥的小克隆增長成為主要克隆，也可導(dǎo)致血液腫瘤復(fù)發(fā)。這些提示攻克血液腫瘤需要多種方法、多種途徑。由于化療、放療是基因突變的誘變劑，如何減少誘變劑，防止細(xì)胞發(fā)生新的基因突變，從而減少耐藥或復(fù)發(fā)也是需要進(jìn)一步研究探討的。

目前全基因組測序、全外顯子測序、目標(biāo)基因的測序等多種技術(shù)的相繼開展，基因信息迅速增長，如何判讀這些信息，哪些是不同人的多態(tài)性，哪些是致病的基因突變還是需要深入研究的問題。血液腫瘤是多個基因突變引起的，每個患者可有多個基因突變，每個基因突變的類型也可有多種，相同的基因在不同患者中的突變類型也不同，其臨床意義也不同，不同突變之間可以相互作用，每個患者的基因突變類型組合等共同組成了患者疾病的獨(dú)特性，這就造成了解讀血液腫瘤基因突變臨床意義的復(fù)雜性。

經(jīng)過十余年的快速發(fā)展，第二代高通量基因測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出成熟的檢測平臺，并且成為近年來分子診斷技術(shù)進(jìn)展的重點(diǎn)。第三代基因測序技術(shù)目前正在開展，尤其在單個測序結(jié)果的讀取方面具有顯著的優(yōu)勢，但還尚無非常成熟的產(chǎn)品。

5.3基因芯片技術(shù)這是較第二代高通量基因測序技術(shù)更早發(fā)展的分子生物學(xué)檢測技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)在大規(guī)模單核苷酸多態(tài)性檢測和基因表達(dá)譜分析上有一定的優(yōu)勢。目前單核苷酸多態(tài)性芯片已經(jīng)成為疾病風(fēng)險預(yù)測等檢測的主流選擇。與傳統(tǒng)的比較基因組雜交技術(shù)相比，對CNV分析更有優(yōu)勢，具有其他技術(shù)難以替代的特點(diǎn)。因?yàn)槟[瘤和遺傳病經(jīng)常會有某個基因所在的染色體片段丟失或拷貝數(shù)的增加，有時可能是某個基因的一部分發(fā)生了缺失，即CNV。但當(dāng)缺失的片段長度在數(shù)千至數(shù)百萬堿基之間時，染色體核型分析（適于檢測數(shù)百萬堿基以上的片段變化）并不能發(fā)現(xiàn)，而基因測序（適于檢測數(shù)百個堿基長度以下的片段變化）亦難以檢出。CNV芯片通過使用幾十萬至數(shù)百萬個分布于基因組上探針信號的檢測，可以分析全基因組范圍的所有連續(xù)超過數(shù)千個堿基以上的片段缺失或擴(kuò)增，彌補(bǔ)了上述兩種檢測技術(shù)之間的不足。

綜上所述，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因組學(xué)的發(fā)展，對血液腫瘤的檢驗(yàn)途徑有了更多的選擇。然而由于新技術(shù)正處于發(fā)展階段，很多方面有待開發(fā)和完善，且不同的檢測技術(shù)均有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。因此，針對不同情況選擇適宜的檢驗(yàn)技術(shù)，才是獲得對臨床有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)的關(guān)鍵。而結(jié)合多種檢測方法，整合診斷報告，為臨床診斷提供更準(zhǔn)確、更有效的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，也是今后值得探討和思考的方向。

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（本文編輯:陳淑蓮）

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.001

（2015-10-24）