曲　芬　毛遠(yuǎn)麗

臨床研究

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用體會

曲芬毛遠(yuǎn)麗

作者單位:100039北京市，解放軍302醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 （matrix-assisted laser desorption ionisation time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)是一項應(yīng)用于細(xì)菌全細(xì)胞快速檢測的新技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡便、檢測快速、準(zhǔn)確、價格低廉的特點。既彌補了傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法檢測時間長的缺點，又降低了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，適用于細(xì)菌性感染患者，尤其是危重癥患者的快速檢測，為臨床救治爭取了寶貴的時間。MALDI-TOF-MS技術(shù)在臨床微生物檢驗中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前該技術(shù)的應(yīng)用仍有一定的局限性，其檢測的準(zhǔn)確性受被測菌純度、實驗操作等的影響，且對某些菌種的鑒定準(zhǔn)確性不高，對病毒檢測的過程較復(fù)雜等。因此，對MALDI-TOF-MS技術(shù)的應(yīng)用局限性以及其在細(xì)菌耐藥性的常規(guī)檢測和菌種質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的擴展等方面仍需進一步的探索研究。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；細(xì)菌鑒定；病毒檢測；藥敏試驗；革蘭陰性桿菌；革蘭陽性菌；真菌

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 （matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近幾年快速發(fā)展起來的一項應(yīng)用于細(xì)菌全細(xì)胞快速檢測的技術(shù)。其核心技術(shù)是利用激光輻射樣品與基質(zhì)的共結(jié)晶體，基質(zhì)分子吸收能量與樣品解吸附并使樣品電離，經(jīng)過飛行時間檢測器，將不同質(zhì)荷比（m/z）的離子分開，形成細(xì)菌特異性的質(zhì)譜圖，軟件自動將待測細(xì)菌質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌庫進行比較，來確定病原菌的種屬。臨床上細(xì)菌性感染由于病情急、重而受到普遍重視，病原學(xué)的快速診斷是提高搶救成功率的關(guān)鍵，也是處理突發(fā)疫情的必要條件。而細(xì)菌生長慢的特性使得其培養(yǎng)時間長、鑒定速度慢，成為快速診斷的瓶頸。德國布魯克公司的MALDI Biotyper型鑒定儀是專門針對微生物快速鑒定而設(shè)計，為臨床微生物快速診斷帶來革命性突破，于2008年首次進入臨床檢驗實驗室，并在歐美國家得到蓬勃發(fā)展。我院自2011年應(yīng)用MALDI Biotyper型鑒定儀鑒定臨床分離病原菌23 560株，并成功獲批軍隊新技術(shù)準(zhǔn)入。該鑒定儀具有簡便、快速、準(zhǔn)確、低耗的特點，也有值得改進及開發(fā)的功能，現(xiàn)將其臨床應(yīng)用體會報告如下。

1　MALDI-TOF-MS技術(shù)的特點

1.1質(zhì)譜庫豐富MALDI Biotyper型鑒定儀的Microflex質(zhì)譜庫覆蓋范圍較廣泛，涵蓋了臨床常見的分離細(xì)菌及真菌，同時德國布魯克公司對質(zhì)譜庫進行不定期更新，客戶也可以根據(jù)實際情況擴增質(zhì)譜庫。質(zhì)譜庫最初包括21個菌屬、113個菌種、4100余株菌株，現(xiàn)已擴展到380個菌屬、2250個菌種、5500余株菌株，以及超過100 000組質(zhì)譜信號，包括臨床少見或生長慢及難培養(yǎng)的分枝桿菌、奴卡菌、軍團菌、厭氧菌、原壁菌屬、李斯特菌屬、奈瑟菌屬，也涵蓋高致病性細(xì)菌如弗朗西斯菌屬、炭疽芽孢桿菌、類鼻祖伯克霍爾德菌、霍亂弧菌和布氏桿菌。

1.2操作簡便MALDI Biotyper型鑒定儀具有簡便、微量、自動化的特點。主要流程只需要單菌落點靶板、加微量基質(zhì)、靶塊快速上機、軟件自動判別結(jié)果，可實現(xiàn)批量鑒定，不需要革蘭氏染色或氧化酶試驗等附加試驗，根據(jù)分值可以確定鑒定的屬與種的可信度。儀器維護簡便，具備紅外激光自動清洗離子源，通過軟件自動提醒、一鍵式啟動，15 min內(nèi)就可以把離子源清洗干凈。

1.3檢測時間短MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測速度快，每個樣品測定時間僅需20 s，每30 min可測96個樣品，批量檢測速度更快。與傳統(tǒng)的鑒定方法比較，普通細(xì)菌提早16-18 h，酵母樣真菌提早24-48 h，絲狀真菌48 h至 7 d，慢生長細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌提早2-6 w［1］。為細(xì)菌性感染的患者特別是重癥患者的救治爭取到寶貴的時間，更適合突發(fā)疫情的應(yīng)急處理。

1.4成本低廉前期除了儀器的投入，另外僅需要購買基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸和基質(zhì)溶劑乙醇、乙腈和甲酸，這些試劑價廉、基質(zhì)用量少（1 μl）、使用時間較長，96孔不銹鋼靶板清洗后可以長期重復(fù)利用，大大降低了檢驗成本。

1.5鑒定準(zhǔn)確MALDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用最廣泛、最成熟的是鑒定臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)的細(xì)菌純菌落，由于測定的是病原菌的核糖體蛋白，因此具有很高的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)庫覆蓋臨床常見的細(xì)菌，包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌以及真菌的不同菌屬及種。Benagli等［2］用MALDI-TOF-MS與Phoenix、API和16S rDNA序列分析方法對1019株菌進行比較研究，證明加德納菌、屎腸球菌和糞腸球菌等與其他常規(guī)方法的鑒定一致率分別為97.4%、100%、100%，其結(jié)果與16S rDNA序列分析幾乎100%吻合，但是鶉雞腸球菌、鏈球菌屬的鑒定一致率較低，分別為44.4%和78.9%。我們目前已鑒定臨床病原菌23 560株，包括細(xì)菌的43個菌屬，132個菌種，真菌的8個菌屬、21個菌種。其中與VITEK 2 compect全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定平行對照8622株，直接臨床檢測14 838株，對兩種方法不一致的結(jié)果以16S rDNA序列分析方法確定。結(jié)果表明，MALDI-TOF-MS技術(shù)對不同菌屬與不同菌種的鑒定能力有差別，主要體現(xiàn)在:（1）主要革蘭陰性菌在屬和種水平上與VITEK 2 compect全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果的符合率分別為大腸埃希菌屬 （3277株）99%和99%、克雷伯菌屬（1224株）97%和94%、假單胞菌屬（743株）94%和89%、不動桿菌屬（366株）94%和76%、腸桿菌屬（266株）93%和73%、檸檬酸桿菌屬（123株）95%和84%、沙雷菌屬（84株）93%和88%、氣單胞菌屬（72株）99%和52%、沙門菌屬（58株）100%和60%（僅鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌可鑒定到種）、布魯菌屬（42株）100%和100%、弧菌屬（36株）83%和33%、羅爾斯頓菌屬（12株）100%和100%；（2）主要革蘭陽性菌在屬和種水平上與VITEC II鑒定結(jié)果的符合率分別為葡萄球菌屬（434株）98%和94%，鏈球菌屬（146株）77%和77%，腸球菌屬 （121株）98%和98%；（3）主要真菌在屬和種水平上與VITEC II鑒定結(jié)果的符合率分別為酵母樣真菌 （227株）98.68%和90.31%、絲狀真菌（100株）94%和52%。鑒定范圍除臨床常見病原菌外，也成功鑒定了2株彎曲菌、4株放線菌、4株奴卡菌、8株厭氧菌和22株抗酸桿菌。MALDI Biotyper型鑒定儀對不同菌種的鑒定能力除了與細(xì)菌蛋白特征有關(guān)外，也與菌種質(zhì)譜庫是否涵蓋該菌屬（種），以及操作過程有關(guān)。

2　MALDI-TOF-MS技術(shù)的臨床應(yīng)用

2.1血培養(yǎng)陽性病原菌的鑒定MALDI Biotyper型鑒定儀可使用配套的血培養(yǎng)分析試劑盒（MALDI Sepsityper Kit）用于血培養(yǎng)陽性菌液的直接測定，但成本較高。我們以低成本的無菌體液直接離心及陽性血培養(yǎng)瓶加溶血素等處理亦可得到較好的結(jié)果。到目前從陽性腹水及引流液陽性培養(yǎng)瓶中直接提取菌種蛋白，用質(zhì)譜儀進行鑒定，正確鑒定細(xì)菌162株，真菌7株，從陽性血培養(yǎng)瓶經(jīng)前處理直接質(zhì)譜儀鑒定細(xì)菌83株，均與純培養(yǎng)后鑒定結(jié)果一致，其中包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、酵母樣真菌及絲狀真菌。

對于臨床實驗室常見的分離株而MALDI-TOF-MS鑒定儀尚未涵蓋的菌種，我們可以設(shè)計并建立質(zhì)譜庫，擴大其應(yīng)用范圍，目前通過自建庫方式實現(xiàn)了對宋內(nèi)志賀菌、馬耳他布氏桿菌的準(zhǔn)確鑒定。

2.2耐藥性的檢測MALDI-TOF-MS技術(shù)對細(xì)菌耐藥性的檢測潛能也正在逐漸被挖掘。其中研究較多且較成熟的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillinsensitive Staphylococcus aureus，MSSA）［3，4］。在Edwards-Jones等［5］對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）的耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，MRSA的質(zhì)譜圖包含多個峰，顯著高于MSSA的峰，且MRSA與MSSA都有各自的特征峰。Majcherczyk等［4］研究顯示，MALDI-TOF-MS技術(shù)能夠區(qū)分基因型相同而耐藥性不同的菌株。特征性圖譜是其鑒別菌株的重要前提，另外也可以通過尋找耐藥菌株的特征性毒力因子來確定耐藥菌，如Bittar等［6］人發(fā)現(xiàn)殺白細(xì)胞毒素的標(biāo)記物（m/z=4448）是SA耐藥株。Wolters等［7］對MRSA中的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a檢測的研究表明，通過檢測PBP2a可迅速確認(rèn)SA中的甲氧西林耐藥表型。

MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥菌，其機制主要是通過耐藥菌株與抑制β-內(nèi)酰胺酶的抗生素共培養(yǎng)，在β-內(nèi)酰胺酶存在條件下氨芐青霉素脫羧水解，改變了抗生素化合物的分子質(zhì)量，MALDI-TOF-MS鑒定儀通過檢測分解產(chǎn)物（酶切產(chǎn)物），從而間接證明耐藥酶的存在。被測菌株需要與抗生素共同孵育1-3 h，以產(chǎn)生足以被檢測到的酶切產(chǎn)物。這種檢測酶切產(chǎn)物的原理也可以應(yīng)用到其他產(chǎn)酶類細(xì)菌的抗性機制研究，如各種耐青霉素類、耐頭孢菌素類和耐碳青霉烯類產(chǎn)酶細(xì)菌［8-10］。

3　MALDI-TOF-MS技術(shù)臨床應(yīng)用的局限性

3.1菌落純度要求嚴(yán)格不管是固體培養(yǎng)基的菌落還是液體培養(yǎng)液必須保證被測菌種是純的，菌落不純或細(xì)菌混合感染均會導(dǎo)致檢測失敗。

3.2某些菌種鑒定困難MALDI-TOF-MS技術(shù)對一些微生物如志賀菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌甲型溶血性鏈球菌（需要做奧普托確證試驗）、嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、氣單胞菌的不同種，無色桿菌屬某些種，產(chǎn)堿菌株某些種，李斯特菌不同種的鑒定不盡如人意，可能與細(xì)菌之間的親緣關(guān)系相近或特殊蛋白指紋圖譜峰的特征性不明顯有關(guān)，需要在實際臨床應(yīng)用中不斷探索［11，12］。

3.3操作過程的影響選取的菌落純度、點靶是否均勻、菌膜的厚薄均會影響檢測結(jié)果的分值，從而影響鑒定的準(zhǔn)確性。直接點靶革蘭陰性菌較革蘭陽性菌更容易鑒定成功。

3.4質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的完善質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫雖然不定期更新，但一些新型、少見菌屬或菌種的鑒定仍可能因質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫缺少相應(yīng)的數(shù)據(jù)而導(dǎo)致鑒定失敗，因此仍需要不斷完善和豐富質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

3.5尚未實現(xiàn)細(xì)菌藥敏試驗的常規(guī)檢測MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀基于細(xì)菌耐藥機制檢測的研究尚處于起步階段，需結(jié)合不同菌種的耐藥機制進行研究，或結(jié)合其他方法共同完成耐藥檢測。

3.6病毒檢測的局限性采用MALDI-TOF-MS技術(shù)診斷病毒感染還不是很成熟，其檢測的結(jié)果受PCR反應(yīng)的影響，引物的設(shè)計要求比較高，質(zhì)譜核酸檢測對樣本的純度要求很高，PCR反應(yīng)體系中的離子會影響質(zhì)譜檢測的分辨率和信號強度，因此對樣本需要進行很好的純化，這使得檢測的過程更加復(fù)雜［13，14］。

MALDI-TOF-MS技術(shù)在臨床實驗室的應(yīng)用體現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、方便、低成本的優(yōu)越性，適合于常規(guī)微生物實驗室檢測，為細(xì)菌性感染患者特別是重癥患者的救治爭取到寶貴的時間，具有很好的應(yīng)用前景。但是，無菌體液、血液感染的培養(yǎng)液直接檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法的探索、細(xì)菌耐藥性的常規(guī)檢測、親緣關(guān)系相近病原菌的識別，以及臨床菌種質(zhì)譜庫的擴展等問題，使得MALDI-TOF-MS技術(shù)的應(yīng)用還需要進一步的開發(fā)與探索。

1鮑春梅，陳素明，崔恩博，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定革蘭陰性桿菌的研究.實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4: 96-99.

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（本文編輯:李霦）

毛遠(yuǎn)麗，E-mail:maoyuanlee@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.012

（2015-09-11）