肖君，張函，謝敏杰，王偉，何丹

缺氧/復(fù)氧條件下體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)生長因子分泌的變化

肖君，張函，謝敏杰，王偉，何丹

目的：觀察缺氧/復(fù)氧（H/R）條件下體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的活力變化及神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）的合成和分泌的變化。方法：采用原代培養(yǎng)的新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞，分為正常（N）組及H/R組。在H/R不同時間點，應(yīng)用倒置顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，并結(jié)合臺盼藍染色，明確缺氧不同時間對星形膠質(zhì)細胞形態(tài)和活力的影響。在H/R不同時間后，應(yīng)用ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中NGF蛋白的含量，應(yīng)用qRT-PCR檢測NGF mRNA的表達。結(jié)果：缺氧6 h、復(fù)氧48 h內(nèi)，H/R組的星形膠質(zhì)細胞的細胞活力未發(fā)生明顯改變。在缺氧6 h、復(fù)氧12 h以及24 h后，H/R組的NGF mRNA表達量及蛋白的分泌較N組顯著增加（<0.01）。結(jié)論：H/R條件可促進體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞NGF的分泌及合成量的增加。

星形膠質(zhì)細胞；神經(jīng)生長因子；缺氧/復(fù)氧

腦缺血再灌注損傷是很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、顱腦損傷等共同的病理過程，其發(fā)生與發(fā)展會導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡，引起腦水腫、腦疝甚至腦死亡等嚴重后果，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良[1,2]。目前仍未闡明其確定機制，以及發(fā)現(xiàn)有確切療效的腦保護劑[3]。因此，抑制腦缺血再灌注損傷并研發(fā)靶向神經(jīng)保護干預(yù)策略，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。

神經(jīng)營養(yǎng)因子家族（neurotrophic factors，NTFs）是一類分泌蛋白，具有調(diào)控神經(jīng)細胞存活和功能維持的作用，包括神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源 性神經(jīng) 營養(yǎng)因 子（brain-derived neurotrophic factor，BNDF）、神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子 （glial cell line-derived neurotrophic factor，GNDF）等，每一種都在神經(jīng)損傷恢復(fù)過程中有重要作用[4,5]。NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是Levi-Montalcini在1951年首次發(fā)現(xiàn)的[6]，它可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，減少神經(jīng)變性，具有刺激軸突再生以及促進神經(jīng)細胞存活、生長及分化的作用[7]。多項研究表明，在腦缺血時，星形膠質(zhì)細胞活化，NGF表達量升高，對神經(jīng)元的存活起重要的保護作用[8-10]。本研究通過建立體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，觀察腦H/R對星形膠質(zhì)細胞NGF合成以及釋放的影響，探討腦缺血時NGF分泌及表達對神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生2 d以內(nèi)的SD大鼠乳鼠40只，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與材料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（購自美國Hyclone公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI）、臺盼藍及多聚賴氨酸（購自美國Sigma公司）；兔抗多克隆GFAP抗體（購自美國Neomarkers公司）；NGF ELISA試劑盒（購自美國Millipore公司）；RT-PCR試劑盒（購自美國Ferments公司）；兔抗NGF多克隆抗體及羊抗兔HRP二抗（購自英國Abcam公司）；GAPDH兔抗單克隆抗體（購自美國Santa Cruz Biotechnology公司）；CY3標記驢抗兔IgG（購自美國Jackson公司）。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及鑒定 參考Kliot等[11]的方法，無菌條件下取新生大鼠的大腦皮質(zhì)，眼科剪剪碎后，經(jīng)直徑200目的篩網(wǎng)過濾，800 rpm離心8m in，去除上清，加入全培養(yǎng)基（DMEM/F12+20%胎牛血清）重懸，接種到多聚賴氨酸（0.1mg/mL）包被過的培養(yǎng)瓶，置于37℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔2～3 d換液一次。細胞生長至融合時按1∶（2～3）傳代至新培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞按照形態(tài)特點和免疫熒光染色進行鑒定。實驗所用細胞為傳2代細胞。通過GFAP免疫熒光染色對細胞進行鑒定。處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化后接種至12孔板中，無水甲醇固定15 m in，0.2%Triton-PBS液中破膜15m in，10%BSA-PBS封閉2 h，多克隆兔抗GFAP（1∶200）4℃過夜，Cy3標記驢抗兔IgG（1∶200）室溫下孵育1 h。細胞核用DAPI標記（室溫下5m in）。每個觀察點隨機取3個200倍視野進行觀察計算，計數(shù)綠色熒光細胞占所有細胞（藍色熒光）的比例。

1.2.2 H/R模型建立及實驗分組 H/R模型建立：采用缺氧孵箱法，將含5%CO2正常培養(yǎng)箱中的星形膠質(zhì)細胞置于94% N2、1%O2及5%CO2的缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境中缺氧不同時間點（3、6、12 h），再復(fù)置于含5%CO2正常培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)相應(yīng)時間點（0、12、24、48、72 h），進行后續(xù)實驗。將體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞分為2組：正常（normal，N）組及H/R組。

1.2.3 評估H/R對細胞活力的影響 分別通過星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)觀察及臺盼藍染色法對細胞活力進行評估。星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)觀察：將細胞培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及貼壁與生長情況，研究缺氧不同時間點（3、6、12 h）星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變。臺盼藍染色法于H/R不同時間點（0、12、24、48、72 h）測定細胞死亡率，從而判斷星形膠質(zhì)細胞的活力。具體步驟按照Patterson[12]的方法進行，每個時間點取3孔，0.4%臺盼藍溶液染色，3m in內(nèi)隨機計數(shù)200個相鄰細胞中藍染細胞（死亡細胞）和未藍染細胞（存活細胞）個數(shù)，計算細胞死亡百分比，結(jié)果以%表示。

1.2.4 ELISA檢測培養(yǎng)上清NGF蛋白濃度 按照ELISA試劑盒的操作說明書步驟，每個樣本取細胞培養(yǎng)上清液100μL，檢測各組培養(yǎng)上清中NGF蛋白的濃度。

1.2.5 qRT-PCR檢測NGFm RNA的表達用Trizol法提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBR Green Mix 10μL、上下游引物各1μL、cDNA1μL、ddH2O 7μL配制 20μL的real-time PCR體系，在ABI7 100 real time PCR儀上進行反應(yīng)。各引物設(shè)計如下：NGF（上游：5'-TGGACCCAAGCTCACCTCA-3'，下游：5'-GTGGATGAGCGCTTGCTCCT-3'），β-actin（上游：5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游：5'-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'）。讀取各組CT值，用ΔΔCT法計算相對表達量差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量結(jié)果以（均數(shù)±標準差）表示，單因素方差分析（one-way ANOVA），<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 2組復(fù)氧不同時間點星形膠質(zhì)細胞死亡比較[個(%)，±s]

注：與N組比較，①<0.01

組別 0 h 12 h 24 h 48 h 72 h N組 2.33±1.53 （1.17±0.76）3.33±1.53 （1.67±0.76）5.33±0.58 （2.67±0.29）7.67±0.58 （3.83±0.29）11.33±1.53 （5.67±0.76）H/R組 2.12±0.16 （1.06±0.08）3.66±1.68 （1.83±0.84）5.67±1.53 （2.83±0.76）8.33±0.58 （4.17±0.29）19.33±3.06 （9.67±1.53）①

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

顯微鏡下可見分離的原代培養(yǎng)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞種植后分散均勻，1 d后基本貼壁，細胞呈梭形或圓形，細胞體小，折光性高；在培養(yǎng)第5～7天分化成熟，形成密集的細胞網(wǎng)絡(luò)，細胞體變大，呈放射多分支狀，折光性低。經(jīng)原代培養(yǎng)傳2代時用GFAP和DAPI雙標免疫熒光染色鑒定其純度，（97.96±3.76）%的細胞為星形膠質(zhì)細胞，符合實驗要求，見圖1。

2.2 H/R不同時間點星形膠質(zhì)細胞活力的變化

在缺氧干預(yù)3、6、12 h進行觀察，鏡下可見隨著缺氧時間的延長，星形膠質(zhì)細胞的細胞體皺縮，折光性減低，細胞貼壁不牢，出現(xiàn)細胞碎片增多。缺氧6 h內(nèi)，H/R組細胞較N組形態(tài)學(xué)變化尚不明顯，缺氧12 h時H/R組星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)大量空泡，細胞破碎甚至死亡，視野中幾乎見不到形態(tài)完整的細胞，見圖2。因此，本實驗選擇缺氧6 h作為后續(xù)的干預(yù)時間，以排除細胞死亡對實驗結(jié)果的影響。

臺盼藍染色鑒定缺氧6 h復(fù)氧不同時間點的細胞死亡率顯示，隨著復(fù)氧時間的延長，藍染細胞的數(shù)目逐漸增多，見表1。復(fù)氧48 h內(nèi)，H/R組星形膠質(zhì)細胞的死亡率較N組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），復(fù)氧72 h時，細胞死亡率明顯高于N組（<0.01）。這表明，與N組比較，H/R組缺氧后復(fù)氧48 h內(nèi)不會引起顯著的細胞死亡，為了排除細胞死亡對實驗結(jié)果的影響，后續(xù)實驗的檢測時間控制在復(fù)氧48 h內(nèi)。

2.3 H/R后2組星形膠質(zhì)細胞分泌NGF的變化

與N組相比，H/R組細胞培養(yǎng)液中的NGF蛋白的濃度隨著復(fù)氧時間的增加而增高，在缺氧6 h、復(fù)氧0～12 h內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在復(fù)氧24 h及48 h時NGF濃度分別為N組的1.38倍和1.54倍，有顯著性差異（<0.01），見圖3A、表2，這表明H/R損傷可刺激體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞NGF蛋白的分泌增加。

2.4 H/R后2組星形膠質(zhì)細胞NGF mRNA的表達變化

表2 復(fù)氧不同時間點2組星形膠質(zhì)細胞分泌NGF蛋白比較（pg/mL，±s）

注：與N組比較，①<0.01

組別 0 h 12 h 24 h 48 h N組 96.21±7.16 102.30±6.88 104.40±5.11 105.60±6.51 H/R組 100.82±3.69 112.10±1.25 144.10±8.70① 162.60±6.24①

缺氧6 h、復(fù)氧不同時間點，N組的星形膠質(zhì)細胞有一定量的NGF mRNA的表達，其表達量較恒定；與N組相比，H/R組的NGF mRNA在缺氧6 h、復(fù)氧0～12 h內(nèi)表達量輕度增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05）；在復(fù)氧12 h、24 h和48 h時表達量明顯增加（<0.01），與ELISA檢測結(jié)果基本一致，見圖3B、表3。

3 討論

星形膠質(zhì)細胞作為大腦中含量最豐富的細胞類型，能夠?qū)ι窠?jīng)元提供代謝和營養(yǎng)支持，調(diào)控突觸可塑性，生理情況下通過合成和釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子（如NGF）來支持神經(jīng)元，維持大腦功能的穩(wěn)定[13]。在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等，星形膠質(zhì)細胞通過釋放NGF發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14-17]。眾所周知，在腦缺血早期，星形膠質(zhì)細胞活化 增生，起到促進神經(jīng)元的修復(fù)、軸突生長和神經(jīng)功能性恢復(fù)的作用[7,8]。由此筆者推測，腦缺氧時，星形膠質(zhì)細胞NGF表達量增加，NGF通過調(diào)控神經(jīng)元的存活和生長，減少神經(jīng)損傷的發(fā)生。

表3 復(fù)氧不同時間點2組星形膠質(zhì)細胞表達NGF mRNA比較（±s）

注：與N組比較，①<0.01

組別 0 h 12 h 24 h 48 h N組 1.00±0.06 1.08±0.15 1.12±0.23 1.09±0.11 H/R組 1.01±0.17 1.34±0.28① 1.50±0.19① 1.64±0.38①

為了驗證上述假說，本研究探討H/R對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞活力變化及NGF的合成和分泌的影響。本研究首先通過倒置顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細胞缺氧不同時間點的形態(tài)改變，從而確定缺氧6 h為干預(yù)時間，然后通過臺盼藍染色檢測復(fù)氧不同時間點下星形膠質(zhì)細胞細胞死亡率的變化，發(fā)現(xiàn)H/R組在單純?nèi)毖? h/復(fù)氧48 h以內(nèi)，星形膠質(zhì)細胞的細胞死亡率較N組并無明顯變化，提示在此實驗條件下不會引起星形膠質(zhì)細胞的死亡。本研究進一步通過 ELISA和qRT-PCR法檢測復(fù)氧不同時間點大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞NGF的蛋白分泌及mRNA的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)氧12 h后及24 h后，H/R組NGFm RNA的表達量及蛋白的分泌較N組有顯著增加。在體實驗中，賈杰等[18]在大鼠腦缺血急性期腹腔注射NGF，觀察到MCAO組缺血再灌注損傷程度較對照組明顯減輕，也提示NGF對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮腦保護作用。Chiaretti等[19]進行在體實驗發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射NGF可以增加局部腦血流，減少腦梗死體積，并且顯著改善腦缺血缺氧損傷后的腦功能。因此，本研究的結(jié)果提示星形膠質(zhì)細胞在H/R時通過增加NGF合成，促進其分泌，發(fā)揮腦保護作用，為進一步研究促進神經(jīng)損傷后修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)于腦缺血損傷時星形膠質(zhì)細胞NGF的合成及分泌變化，不同學(xué)者有不同觀點。Isackson等[20]發(fā)現(xiàn)，在正常的成年大腦中，NGF主要在神經(jīng)元上表達，并且對星形膠質(zhì)細胞NGF的釋放起抑制作用；在神經(jīng)損傷時，星形膠質(zhì)細胞活化增殖，NGF的表達量明顯增高，他們認為星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)損傷后NGF表達量的增高有關(guān)[9]。而另有研究卻發(fā)現(xiàn)包括NGF在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子在糖氧剝奪1 h，再灌注24 h的情況下，其表達量下調(diào)[21]。結(jié)論的不一致可能與實驗條件、缺氧模型構(gòu)建方法不同、缺氧及再灌注的時間不同所導(dǎo)致。腦缺血時星形膠質(zhì)細胞NGF釋放與損傷的程度和時間窗密切相關(guān)，具體關(guān)系還需進一步研究來闡明。

綜上所述，筆者認為，H/R情況下可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞NGF的合成和釋放的增加，提示星形膠質(zhì)細胞活化所釋放的NGF在腦缺血再灌注情況下可能發(fā)揮一定的腦保護作用，其腦保護時間窗和作用機制還有待進一步研究。

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（本文編輯：王晶）

Objective:To investigate the secretion of nerve growth factor(NGF)in primary cultured astrocytes under hypoxia/reoxygenation (H/R).Methods:Primary cultured rats cortical astrocytes were used,which were randomly assigned into groups of normal control(N group)and hypoxia/reoxygenation(H/R group).Morphological observation of the astrocytes was detected by inverted phase contrast microscopy as an index of cellular damage under hypoxia.And tyrpan blue staining was applied to detect the cell injury rate at different time after reoxygenation.The levels of NGF protein were analyzed by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA).And qRT-PCR was used to determine the levels of NGF mRNA.Results:The astrocytes viability of the H/R group has no significant changed after 6 h hypoxia and 48 h reoxygenation.Compared with the N group,the NGF mRNA level of the H/R group was remarkably increased after 24 h reoxygenation and 6 h hypoxia(<0.01),and the level of NGF protein secretion of the H/R group increased significantly as well after48 h reoxygenation and 6 h hypoxia(<0.01).Conclusion:Hypoxia/reoxygenation effectively increased the expression of NGF in primary cultured astrocytes.

astrocyte;nerve growth factor;hypoxia/reoxygenation

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.001

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

國家自然科學(xué)基金（No.81301126，810 30021）；中國博士后科學(xué)基金（No.2013M 53169 9）

2014-07-21

何丹hedan4103@sina.com