王超群 陳洪高 張運鵬

摘要： 利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，從腐爛苧麻稈堆中分離到1株高效纖維降解細(xì)菌，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合16S rRNA基因分子鑒定。結(jié)果表明，該菌屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酶的最適溫度和pH分別為42 ℃和7.0，在該條件下，于100 mL發(fā)酵體系中發(fā)酵降解苧麻纖維，發(fā)酵96 h 后纖維素酶活力達(dá)到最高值24.3 U/mL，發(fā)酵8 d后其纖維降解率為45.1%。

關(guān)鍵詞：苧麻纖維；纖維素酶；16S rRNA；Bacillus cereus

中圖分類號：S563.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0565-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.014

Isolation and Identification of Highly Efficient Degrading Strain of Cellulose in Ramie

WANG Chao-qun，CHEN Hong-gao，ZHANG Yun-peng

（School of Environmental Engineering， Wuhan Textile University，Wuhan 430020， China）

Abstract： A cellulose degrading strain J04 was isolated from rotting ramie straws by using sodium carboxymethylcellulose as a sole carbon source and identified as Bacillus cereus by morphological observation combined with 16S rRNA gene sequencing. The results showed that the optimal temperature and pH for cellulase producing of J04 was 42 ℃ and 7.0， respectively. The highest cellulase activity reached 24.3 U/mL when J04 was grown in a ramie fiber medium for 4 days. About 45.1% was degraded after 8-days incubation under the optimal conditions.

Key words： ramie fiber； cellulase； 16S rRNA； Bacillus cereus

隨著石油資源的日益枯竭、全球能量的需求持續(xù)增長和城市空氣污染的日益嚴(yán)峻，可再生燃料和燃燒后釋放溫室氣體較少的生物燃料正在成為化石燃料的理想替代品。纖維素是地球上最豐富的可再生有機(jī)物資源和重要的生物能源原料。芒草、麻類作物、作物秸稈和木材廢料等都含有豐富的纖維素成分[1]，作為第二代生物能源技術(shù)，歐美各國正在將纖維資源利用重點研發(fā)[2]。

纖維素酶（CMC）是實現(xiàn)纖維素降解的關(guān)鍵酶，只有纖維水解成了可溶性糖，才能被微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化成生物能源[3]。由于真菌纖維素酶不如細(xì)菌纖維素酶那么復(fù)雜，容易分離純化，目前主要用真菌來生產(chǎn)纖維素酶，如木霉、曲霉、青霉、根霉和漆斑霉等[4]。然而，細(xì)菌纖維素酶也具有其獨特的優(yōu)勢，如：細(xì)菌生長較快，比真菌更容易重組出較高產(chǎn)率的纖維素酶；細(xì)菌纖維素酶雖然復(fù)雜但同時也賦予其更多功能，在降解纖維時能夠很好地協(xié)作；細(xì)菌纖維素酶比真菌纖維素酶更能適應(yīng)酸、堿、熱、鹽等極端環(huán)境，具有更廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。因此，細(xì)菌纖維素酶最近正受到越來越廣泛的關(guān)注[5]。研究較多的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌主要有Bacillus subtilis、Clostridium

acetobutylicum、Clostridium thremocellum和Pseud-ononas cellulose，關(guān)于Bacillus cereus降解纖維的報道并不多見。

本研究從腐爛苧麻稈堆中篩選出1株高效降解苧麻纖維的微生物，優(yōu)化其發(fā)酵條件，研究其產(chǎn)酶特征，鑒定其種屬，為苧麻生物量的高效利用探索途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物 從咸寧湖北新農(nóng)生態(tài)麻業(yè)有限公司園區(qū)一個長期露天堆置的苧麻稈堆中收集正在腐爛麻稈殘渣約200 g，立即帶回實驗室用500 mL無菌水浸洗，然后用雙層紗布過濾去除殘渣，濾液4 000 r/min離心10 min，上清液作為菌源備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g/L，K2HPO4 1 g/L， Na2CO3 5 g/L， MgSO4·7H2O 0.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

CMC-Na分離培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15g/L，酵母膏0.2 g/L，KH2PO4 1g/L， NH4NO3 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

CMC-Na篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g/L，KH2PO4 1 g/L， NH4NO3 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121 ℃滅菌30 min。培養(yǎng)4 d后用剛果紅進(jìn)行染色鑒定。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏0.2 g/L，蛋白胨3 g/L，CMC-Na 10 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L， KH2PO4 4 g/L， MgSO4·7H2O 0.3g/L， CaCl2·2H2O 0.3 g/L， pH自然，121 ℃滅菌30 min。

苧麻纖維發(fā)酵培養(yǎng)基：苧麻纖維20 g/L，酵母膏 4 g/L，NH4NO3 4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， KH2PO4 4 g/L，pH自然，121 ℃滅菌30 min。（將除苧麻纖維之外的部分配成溶液儲存，滅菌的苧麻纖維臨用時加入。）

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 取20 mL菌原液接種到80 mL富集培養(yǎng)基中，42 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.2 初篩 取富集培養(yǎng)液稀釋成10-3、10-4、10-5，涂布于CMC-Na固體培養(yǎng)基，每個稀釋梯度涂布3個平板，42 ℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，然后在相同的培養(yǎng)基上通過反復(fù)劃線分離單菌落。

水解圈試驗：挑取分離得到的單菌落點種于CMC-Na篩選培養(yǎng)基上，42 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用1 mg/mL的剛果紅溶液染色平板30 min，再用蒸餾水清洗，最后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，以透明圈的直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，挑選比值較大的菌再進(jìn)行劃線分離，鏡檢確認(rèn)為純的單菌落后，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上保存。

1.2.3 復(fù)篩 將篩選得到的菌種接種到CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基上，42 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，5 000 r/min離心15 min，上清液作為粗酶液測定CMC酶活。酶活測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[6]，取粗酶液0.5mL，加入1% CMC-Na溶液0.5mL，45 ℃反應(yīng)30 min，迅速加入1.5 mL DNS，在100 ℃沸水浴中反應(yīng)5 min，稀釋至10 mL，以在100 ℃沸水浴中保溫20 min失活的粗酶液作為空白，用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在酶標(biāo)儀上540 nm處測定吸光度，計算纖維素酶活。酶活單位定義為：每分鐘水解纖維素產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活單位U。

1.2.4 發(fā)酵溫度與pH條件優(yōu)化 在試驗中，溫度設(shè)置32、37、42 和47 ℃共4個梯度，pH設(shè)置6、7、8、9共4個梯度，每個溫度-pH組合3次重復(fù)。發(fā)酵體系為：在250 mL三角瓶中，預(yù)加100 mL CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%（V/V）接種量添加菌種。將三角瓶置于不同的溫度和pH條件下，150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，5 000 r/min離心15 min，上清液作為粗酶液測定CMC酶活，取平均值用于比較分析。

1.2.5 菌株生長曲線測定 發(fā)酵體系同“1.2.4”，調(diào)節(jié)初始pH 7.0， 42 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)，3次重復(fù)。在分光光度計上，用初始發(fā)酵液作為空白調(diào)零，在波長600 nm下每隔18 h取培養(yǎng)液測定一次吸光度（OD600 nm），連續(xù)測定126 h。

1.2.6 纖維發(fā)酵試驗 將初篩接菌種到1 L CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基上，42 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液作為菌酶混合液備用。在250mL三角瓶中預(yù)加100 mL苧麻纖維發(fā)酵培養(yǎng)基（含2 g滅菌苧麻纖維），接種10 mL菌酶混合液，于 42 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)。共接種30瓶，從接種開始，每隔2 d取出3瓶，用200目篩過濾，濾渣先用稀鹽酸和硝酸混合液沖洗，再用熱水（80～100 ℃）沖洗干凈，105 ℃烘干，稱纖維殘余重量，按如下公式計算失重率，試驗持續(xù)9 d。另外3瓶用于觀測發(fā)酵過程中纖維素酶活力動態(tài)變化，每24 h檢測 1次，直至試驗結(jié)束。失重率及纖維素酶活力取平均值用于分析。

失重率=[G1-G2]÷G1×100%

式中，G1為纖維的初始重量；G2為微生物降解后剩余纖維重量。

1.2.7 菌株分子鑒定 用TaKaRa細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過16S rRNA 基因測序鑒定菌株。PCR引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min變性；94 ℃ 45 s，54 ℃退化45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至三博遠(yuǎn)志公司純化后測序。對測序得到的16S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST分析，在GenBank中進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

經(jīng)過富集培養(yǎng)、劃線分離和水解圈試驗，篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，編號為J04。該菌在CMC-Na篩選培養(yǎng)基上42 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，菌落直徑與水解圈直徑之比約為1∶4。在CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基上42 ℃培養(yǎng)4 d，纖維素酶活為23.6 U/mL。

2.2 菌株的形態(tài)特征

菌株J04呈革蘭氏陽性，直桿菌（圖1a），菌落成短或長鏈排列。芽孢圓形，孢囊無明顯膨大。菌落扁平，圓形或近似圓形，灰白色，不透明，邊緣不規(guī)則，略有光澤，中部略凸起，表面較粗糙，似融蠟狀（圖1b）。

2.3 菌株發(fā)酵的最適溫度與初始pH

由圖2可知，當(dāng)溫度處于37～47 ℃范圍時，發(fā)酵體系中能檢測到較高的纖維素酶活力，其中以42 ℃左右為最佳。在37～47 ℃的范圍內(nèi)，菌株在中性初始pH時產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，但在pH 6～8能保持較高的產(chǎn)酶能力（大于16 U/mL），說明該菌株有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。同時，試驗結(jié)果還表明，當(dāng)溫度低于37 ℃，或pH大于9時，菌株的生長和產(chǎn)酶將明顯受到限制。

2.4 菌株的生長曲線

菌株J04在CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中42 ℃振蕩培養(yǎng)，經(jīng)過約18 h的緩慢生長期后，開始進(jìn)入對數(shù)期生長（圖3）。整個對數(shù)生長期經(jīng)歷了大約54 h，然后進(jìn)入穩(wěn)定期。累計培養(yǎng)108 h后，菌群密度開始呈現(xiàn)出下降趨勢。

2.5 CMC酶活與纖維降解效果

將J04接種到苧麻纖維發(fā)酵培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)至2 d結(jié)束時檢測到纖維素酶活開始上升，在持續(xù)急劇上升3 d（第五天）后接近最大值（24.3 U/mL），（圖4）。纖維的降解速率與發(fā)酵體系中纖維素酶的變化密切相關(guān)，發(fā)酵2 d時檢測到有大約2.6%的纖維被降解，此后隨著纖維素酶活的持續(xù)上升，纖維降解速率明顯加快，在第六天結(jié)束時累計降解18.8%，第八天結(jié)束時累計降解45.1%，表明菌株J04有較強(qiáng)的降解苧麻纖維的能力。

2.6 菌株的16S rRNA基因鑒定

測定序列長度為1 437 bp，將該序列在GenBank中通過Blast進(jìn)行序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)該序列與Bacillus cereus strain D26親緣關(guān)系最近（表1），同源性達(dá)到99%。選取以16S rRNA基因序列同源性為基礎(chǔ)排序的親緣關(guān)系前10位的菌株，同J04一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖6），結(jié)果J04處于一個單獨分支上，說明菌株J04具有相對獨立的進(jìn)化地位。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因序列分析結(jié)果，可將菌株J04初步鑒定為Bacillus cereus。

3 討論

關(guān)于蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的文獻(xiàn)并不多見，Thayer[7]及Ramin等[8]從白蟻腔腸、Lu等[9]從植物堆肥中都曾分離到能產(chǎn)纖維素酶的蠟樣芽孢桿菌，但這些研究多局限于菌種鑒定階段，未見相關(guān)后續(xù)報道。Prakash等[10]從沼澤泥土中、錢林等[11]從湖底沉積物中篩選到了蠟樣芽孢桿菌，這些菌株雖然纖維素酶活力都較高，但實際降解濾紙纖維時表現(xiàn)并不理想。燕紅等[12]從土壤中分離到的蠟樣芽孢桿菌對稻草表現(xiàn)出了較好的降解能力。本試驗從苧麻腐爛堆中再次分離出了蠟樣芽孢桿菌，該菌生產(chǎn)纖維素酶的能力超過了前述的報道，在實際降解苧麻纖維方面的表現(xiàn)也比較突出，兼具降解結(jié)晶和非結(jié)晶纖維的能力，加之其獨特的進(jìn)化地位，表明該菌株可能由于長期處于苧麻稈腐爛堆中而獲得了馴化并累積了突變。

苧麻是中國傳統(tǒng)的多年生宿根纖維作物，對土壤和肥水要求低，適宜種植區(qū)域廣泛，每公頃年產(chǎn)干物質(zhì)22.5 t以上，因而資源比較優(yōu)勢十分突出。然而，目前苧麻總生物量中只有10%左右（韌皮纖維）被有效利用，70%左右（麻稈和麻葉）被廢棄。麻稈和麻葉均含有豐富的纖維成分，因此，苧麻纖維降解高效菌的開發(fā)，對于促進(jìn)苧麻纖維加工廢棄生物質(zhì)的資源化利用具有十分重要的意義。

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