劉 青 顏 天 周名江 張清春 林佳寧

(1.中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;2.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3.中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264003)

大型海洋綠藻大量繁殖或聚集形成的藻華現(xiàn)象為“綠潮(Green Tides)”,是世界沿海各國普遍發(fā)生的一種生態(tài)現(xiàn)象。自2007年以來,我國黃海海域連續(xù)8年發(fā)生了大規(guī)模的綠潮災(zāi)害,該綠潮主要原因種為滸苔Ulva prolifera (Leliaert et al,2009;Shimada et al,2010;中國海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào),2007—2014)。滸苔作為一種機(jī)會(huì)型的大型綠藻,生活史非常復(fù)雜,整個(gè)生命過程由微觀繁殖體階段和可見的藻絲體階段交替進(jìn)行。滸苔微觀繁殖體作為滸苔生長發(fā)育的早期形成產(chǎn)物,主要包括孢子、配子、合子這些無細(xì)胞壁保護(hù)的裸露單細(xì)胞,在適宜的溫鹽等條件下,微觀繁殖體遇到合適附著基就會(huì)固著,進(jìn)而萌發(fā)生長成藻絲體,固著和萌發(fā)是滸苔生長發(fā)育的必要階段(Chapman,1986;Clayton,1992;Fletcher et al,1992;Santelices et al,2002)。大量的調(diào)查數(shù)據(jù)表明滸苔微觀繁殖體不僅是滸苔綠潮形成過程的重要產(chǎn)物,而且作為綠潮發(fā)生的“種子庫”在整個(gè)綠潮的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用(Li et al,2014;Song et al,2015)。

亞歷山大藻是一種世界沿海分布較廣、危害嚴(yán)重的赤潮原因種,由其引發(fā)的赤潮規(guī)模呈現(xiàn)逐年擴(kuò)大的態(tài)勢(shì)。在我國沿岸的南北海域中,亞歷山大藻也廣泛分布,是近年來常見的赤潮生物(周名江等,2003)。該藻不但能產(chǎn)生麻痹性貝毒(PSP,Paralytic Shellfish Poisoning),還產(chǎn)生其它有毒有害物質(zhì)危害海洋生態(tài)環(huán)境(Simonsen et al,1995;Yan et al,2001;Emura et al,2004)。

Jasser(1995)指出形成綠潮的大型海藻可通過與其它浮游植物的相互作用而影響綠潮發(fā)生海域的種類分布與生態(tài)格局;秦玉濤等(2011)發(fā)現(xiàn)滸苔綠潮暴發(fā)期間南黃海海域浮游植物種類、細(xì)胞數(shù)、多樣性均發(fā)生一定變化。Sfriso等(1994)發(fā)現(xiàn)綠潮暴發(fā)的水域赤潮卻很少暴發(fā);夏斌等(2009)在非滸苔區(qū)發(fā)現(xiàn)有小面積的裸甲藻赤潮,臨近的滸苔暴發(fā)海域內(nèi)卻未發(fā)現(xiàn)赤潮。上述研究均反映了自然水體中綠潮對(duì)浮游植物的影響效應(yīng),甚至可以影響赤潮的發(fā)生。

綠潮暴發(fā)后對(duì)海域中浮游植物的影響是通過多種途徑進(jìn)行的,其中部分研究結(jié)果表明大型綠藻的藻體會(huì)通過分泌化感物質(zhì)來影響微藻生長(霍元子等,2010;Wang et al,2013)。滸苔微觀繁殖體作為其生長發(fā)育過程的早期形成產(chǎn)物,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為簡單,對(duì)微藻的影響效應(yīng)的開端和發(fā)展、對(duì)黃海綠潮的貢獻(xiàn),以及微藻對(duì)于滸苔微觀繁殖體的反向作用,目前關(guān)于這類兩者間的相互影響效應(yīng)還未見報(bào)道。

本文針對(duì)以上問題,選取了滸苔微觀繁殖體中極具代表力的配子以及上述常見有害赤潮藻種亞歷山大藻,通過營養(yǎng)鹽充足條件下的滸苔配子與赤潮藻的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)室模擬了滸苔微觀繁殖體早期2個(gè)重要階段(固著和萌發(fā)階段)與亞歷山大藻間的影響作用,以期為綠潮和赤潮相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 微藻與滸苔的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用微藻全部取自中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)ATHK藻株分離自南海香港海域,鏈狀亞歷山大藻(A.catenella)ACDH藻株分離自東海長江口海域,這兩株藻均由暨南大學(xué)提供;微小亞歷山大藻(A.minutum)AM-LYG藻株分離自黃海連云港海域;以上三種亞歷山大藻均可以產(chǎn)生PSP毒素。不產(chǎn)PSP毒素的相關(guān)亞歷山大藻(A.affine)ASCH分離自黃海,由國家海洋局第三海洋研究所提供。將微藻分別在f/2-Si培養(yǎng)液(Guillard,1975)中培養(yǎng)至指數(shù)生長期待用,培養(yǎng)溫度為20°C,光照4000 lx,光暗比為14∶10。實(shí)驗(yàn)海水為管道海水(取自青島太平角),經(jīng)沙濾、沉淀,0.45μm混合纖維濾膜過濾,再用高溫煮沸滅菌。

滸苔采集于青島匯泉灣。將采集的鮮活滸苔去除泥沙,用混合抗生素進(jìn)行滅菌處理,再用滅菌海水漂洗3—4次,鏡檢確認(rèn)無雜藻后,無菌培養(yǎng)于f/2-Si培養(yǎng)液中,同時(shí)添加 1mg/L GeO2以消除硅藻的影響。培養(yǎng)條件、所用海水均同微藻。

1.2 滸苔配子的獲得

采集到滸苔的繁殖方式為單性生殖(Liu et al,2015)。滸苔配子體產(chǎn)生的配子未經(jīng)融合形成合子,而是直接發(fā)育成配子體,繼續(xù)釋放配子完成單性循環(huán)。滸苔配子主要是通過形態(tài)學(xué)觀察及趨光性檢測來判斷: 形態(tài)學(xué)觀察到配子個(gè)體大小約為 6μm×3μm,呈長橢圓形,前端透明,后端為綠色的色素體,細(xì)胞內(nèi)一般含有一個(gè)橘紅色的眼點(diǎn)和一個(gè)蛋白核,頂生兩根鞭毛使其可以快速運(yùn)動(dòng);在趨光性檢測中呈現(xiàn)明顯的正趨光。

利用斷裂的方法誘導(dǎo)滸苔釋放配子(Dan et al,2002)。將單株滸苔配子體切為1—2cm長的片段,放入盛有f/2-Si培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,每天更換新鮮培養(yǎng)液,誘導(dǎo)配子囊的形成。2—3天后,待藻體顏色由淺綠色變?yōu)辄S褐色,在光下刺激滸苔釋放配子,待其釋放完畢變?yōu)榘咨?取出藻段,將配子液收集,迅速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 滸苔配子固著階段與亞歷山大藻的相互影響效應(yīng)

1.3.1 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子固著的影響 實(shí)驗(yàn)采用共培養(yǎng)的方法進(jìn)行,將剛釋放的滸苔配子接種到50mL小燒杯中,其中對(duì)照組為滸苔配子單培養(yǎng)組(培養(yǎng)介質(zhì)為無菌海水),實(shí)驗(yàn)組分別加入四株不同的亞歷山大藻藻株,為滸苔配子與亞歷山大藻共培養(yǎng)組,滸苔配子的終密度設(shè)為 2.0×104cells/mL,微藻密度分別設(shè)為 0.01×104cells/mL和 0.1×104cells/mL,反應(yīng)體系為40mL。每個(gè)小燒杯底部放置1個(gè)蓋玻片,便于固著配子的計(jì)數(shù)。全部對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組避光培養(yǎng)1天,以保證滸苔配子的隨機(jī)固著。1天后取出蓋玻片,在滅菌海水中輕微震蕩數(shù)次,洗去未附著的配子。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察20個(gè)視野(40×10倍),取其平均值計(jì)算固著的配子量,以此固著量作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開始前加入 f/2培養(yǎng)液,保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不受營養(yǎng)鹽的限制。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。

1.3.2 滸苔配子固著對(duì)亞歷山大藻生長的影響實(shí)驗(yàn)同樣采用共培養(yǎng)的方法進(jìn)行,培養(yǎng)條件同1.3.1。但是對(duì)照組為四株亞歷山大藻單培養(yǎng)組,實(shí)驗(yàn)組依舊為滸苔配子與亞歷山大藻共培養(yǎng)組。統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為亞歷山大藻的藻細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后從每個(gè)燒杯中各取1mL藻液,用碘液固定,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次,取其平均值。每個(gè)處理包含3個(gè)平行組。

1.4 滸苔配子萌發(fā)階段與微藻的相互影響效應(yīng)

1.4.1 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子萌發(fā)的影響 實(shí)驗(yàn)開始前1天,將滸苔配子接種到40mL含f/2培養(yǎng)液的 50mL小燒杯中,接種密度為 2.0×104cells/mL,避光培養(yǎng)以保證滸苔配子的隨機(jī)固著。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)恢復(fù)光照培養(yǎng),并分別加入四株不同的亞歷山大藻藻株,對(duì)照組為滸苔配子單培養(yǎng)組,實(shí)驗(yàn)組為滸苔配子與亞歷山大藻共培養(yǎng)組,微藻密度設(shè)置為 0.1×104cells/mL。燒杯底部放置1個(gè)蓋玻片便于觀察配子萌發(fā),實(shí)驗(yàn)持續(xù)7天。每天用顯微鏡計(jì)數(shù)蓋玻片上配子的萌發(fā)率(以分裂為兩細(xì)胞為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)),每個(gè)蓋玻片計(jì)數(shù)20個(gè)視野。萌發(fā)率(%)=N/N0×100% (N0,一個(gè)視野中總的配子數(shù);N,一個(gè)視野中萌發(fā)的配子數(shù))。每次取樣結(jié)束后,向?qū)嶒?yàn)體系中補(bǔ)充200μL f/2營養(yǎng)液,以保證實(shí)驗(yàn)過程中不受營養(yǎng)鹽限制。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。

1.4.2 滸苔配子萌發(fā)階段對(duì)亞歷山大藻的影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件同 1.4.1。但是對(duì)照組設(shè)定為 4株不同的亞歷山大藻單培養(yǎng)組,實(shí)驗(yàn)組為滸苔配子與亞歷山大藻共培養(yǎng)組,以亞歷山大藻細(xì)胞密度作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開始前1天,將滸苔配子接種到40mL含 f/2培養(yǎng)液的 50mL小燒杯中,接種密度為 2.0×104cells/mL,避光培養(yǎng)以保證滸苔配子的隨機(jī)固著。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)恢復(fù)光照培養(yǎng),持續(xù) 7天。每天取出200μL藻液,用碘液固定,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次,取其平均值,計(jì)算微藻細(xì)胞密度。微藻生長抑制率I=(1–N1/N2)×100% (N1為共培養(yǎng)組藻細(xì)胞密度;N2為單培養(yǎng)組藻細(xì)胞密度)。

1.5 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子固著的可能影響效應(yīng)研究

1.5.1 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)不同組分對(duì)滸苔配子固著的影響效應(yīng) 將處于指數(shù)生長期的相關(guān)亞歷山大藻液用10μm篩絹過濾,得到藻細(xì)胞過濾液和藻細(xì)胞,將得到的藻細(xì)胞重新懸浮于滅菌的海水中,得到藻細(xì)胞重懸液。利用超聲波細(xì)胞破碎儀將藻細(xì)胞破碎后,離心 15min,取上清液得到藻細(xì)胞內(nèi)容物,收集到的沉淀則為藻細(xì)胞碎片。將上述組分以滅菌海水稀釋到相當(dāng)于藻細(xì)胞密度為50cells/mL后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

1.5.2 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)去藻過濾液組分對(duì)滸苔配子固著的影響效應(yīng)

(1)溫度和pH對(duì)相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)去藻過濾液毒性的影響 用10μm篩絹過濾相關(guān)亞歷山大藻,得到去藻過濾液,分別置于溫度為60、80、100°C的水浴中處理30min,然后取出恢復(fù)到室溫20°C,進(jìn)行對(duì)滸苔配子固著的影響實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

將得到的去藻過濾液,分別用HCl和NaOH將其pH調(diào)為 2.1、6.1、12.1,30min后再調(diào)回到起始的pH 8.1,進(jìn)行對(duì)滸苔配子固著的影響實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

(2)去蛋白組分對(duì)相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)去藻過濾液毒性的影響 將得到的相關(guān)亞歷山大藻去藻過濾液,加熱蒸發(fā)去除蛋白組分。然后進(jìn)行對(duì)滸苔配子固著的影響實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

1.6 滸苔配子萌發(fā)階段對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長的可能影響效應(yīng)研究

實(shí)驗(yàn)采用共培養(yǎng)的方法進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)方法同1.4.2。對(duì)照組為塔瑪亞歷山大藻(ATHK)單培養(yǎng)組,實(shí)驗(yàn)組分別為滸苔配子、滸苔配子培養(yǎng)過濾液與塔瑪亞歷山大藻共培養(yǎng)組。將密度為 2×104cells/mL的滸苔配子在含 f/2培養(yǎng)液的小燒杯中培養(yǎng),培養(yǎng)液經(jīng)滅菌的0.45μm混合纖維濾膜過濾,得到培養(yǎng)過濾液。立即接種處于對(duì)數(shù)生長期的塔瑪亞歷山大藻,初始密度設(shè)置為0.1×104cells/mL。每隔1天將小燒杯中的培養(yǎng)液移出 4mL,然后添加 4mL新鮮滸苔培養(yǎng)濾液以保持培養(yǎng)液體積的恒定。對(duì)照組添加4mL滅菌海水,實(shí)驗(yàn)時(shí)間7天,計(jì)算微藻生長抑制率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007作圖,SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行樣本檢驗(yàn)分析,所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。并進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),用Duncan進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)和差異顯著性分析,P＜0.05被認(rèn)為是在α=0.05水平上差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子固著與萌發(fā)的影響

2.1.1 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子固著的影響 四株亞歷山大藻藻株對(duì)滸苔配子的固著均有強(qiáng)烈的抑制效應(yīng),并且隨著濃度的升高,其抑制效應(yīng)逐漸加強(qiáng)(圖1)。其中四株亞歷山大藻在生物量為0.01×104cells/mL時(shí)(野外赤潮密度),對(duì)滸苔配子的固著就存在著顯著的影響,最大固著量僅達(dá)到 7cells/mm2,顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);在其密度達(dá)到 0.1×104cells/mL時(shí),與之共存的滸苔配子數(shù)量急劇減少,甚至可以完全“殺死”滸苔配子,從而影響其固著。

以 24h時(shí)滸苔配子的固著量分別對(duì)不同亞歷山大藻藻株的藻密度作圖,并進(jìn)行回歸分析,根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算半致死密度,得出不同亞歷山大藻藻株對(duì)滸苔配子固著的影響大小(圖2): 四株亞歷山大藻在較低生物量水平時(shí)就對(duì)滸苔配子固著產(chǎn)生半數(shù)抑制作用,塔瑪亞歷山大藻(ATHK)、鏈狀亞歷山大藻(ACDH)、相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)和微小亞歷山大藻(AM-LYG)的 24h ID50分別為 12、13、36和49cells/mL。從結(jié)果中可以看出,不產(chǎn) PSP毒素的相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)依然對(duì)滸苔配子的固著存在強(qiáng)烈的抑制作用,所以亞歷山大藻對(duì)滸苔的這種影響效應(yīng)與其所產(chǎn)毒素特征不符,因此其對(duì)滸苔配子固著的抑制作用與赤潮藻毒素?zé)o直接相關(guān)關(guān)系,PSP毒素并非是亞歷山大藻抑制滸苔配子固著的主要原因。

2.1.2 亞歷山大藻對(duì)滸苔配子萌發(fā)的影響 圖3顯示了四株亞歷山大藻對(duì)滸苔配子萌發(fā)率的影響。盡管四種亞歷山大藻在 3—5天對(duì)滸苔配子萌發(fā)表現(xiàn)出了一定的促進(jìn)效果,不同程度地加速了滸苔配子的萌發(fā),但培養(yǎng)7天后實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和處理組的滸苔配子均完全萌發(fā)。即在這些藻種存在的情況下,滸苔配子的萌發(fā)率與對(duì)照組均無顯著差異性。

圖1 四株亞歷山大藻在不同密度下對(duì)滸苔配子固著的影響Fig.1 Effect of four Alexandrium strains in different density on the settlement of U.prolifera gametes

2.2 滸苔配子固著、萌發(fā)階段對(duì)亞歷山大藻的影響

2.2.1 滸苔配子固著階段對(duì)亞歷山大藻生長的影響表 1中分別列出了實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)四株亞歷山大藻在滸苔配子是否存在下的生物量,由于配子固著階段時(shí)間較短(1天),且在黑暗條件下進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量并無顯著性差異(P＞0.05)。所以滸苔配子對(duì)不同株亞歷山大藻的生長并沒有明顯的抑制或“殺死”作用。

圖2 四株亞歷山大藻對(duì)滸苔配子固著的半數(shù)致死密度(24h ID50)Fig.2 The 50% lethal dose (24h ID50)of four Alexandrium strains in different density on settlement of U.prolifera gametes after 24h of treatment

2.2.2 滸苔配子萌發(fā)階段對(duì)亞歷山大藻生長的影響滸苔配子在萌發(fā)階段對(duì)四株亞歷山大藻生長的影響效應(yīng)見圖4: 與對(duì)照組(微藻單培養(yǎng)體系)相比,實(shí)驗(yàn)中各處理組(滸苔與微藻共培養(yǎng)體系)中亞歷山大藻的生長均受到了不同程度的影響。在第 7天對(duì)塔瑪亞歷山大藻(ATHK)、鏈狀亞歷山大藻(ACDH)和微小亞歷山大藻(AM-LYG)的生長抑制率分別達(dá)到27%、18%和 4%,其中塔瑪亞歷山大藻(ATHK)處理組與對(duì)照組相比差異性顯著(P＜0.05),細(xì)胞密度明顯降低;但滸苔配子與相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)共培養(yǎng)過程中對(duì)這株微藻的抑制程度并不明顯,并未達(dá)到顯著性差異水平。

圖3 四株亞歷山大藻對(duì)滸苔配子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of four Alexandrium strains in different culture durations on germination of U.prolifera gametes

表1 滸苔配子在固著階段對(duì)四株亞歷山大藻生長的影響Tab.1 The effect of four Alexandrium strains on growth of U.prolifera at settlement stage

圖4 滸苔配子在萌發(fā)階段對(duì)四株亞歷山大藻生長的影響(*與對(duì)照組差異顯著P＜0.05)Fig.4 Effect of four Alexandrium strains on growth of U.prolifera gametes at germination stage (*P＜0.05 as compared to the control)

2.3 亞歷山大藻抑制滸苔配子固著的可能影響效應(yīng)研究

2.3.1 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)不同組分對(duì)滸苔配子固著的影響效應(yīng) 為進(jìn)一步探討亞歷山大藻對(duì)滸苔配子產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用的致毒機(jī)理,本研究以不產(chǎn)PSP毒素的相關(guān)亞歷山大藻為例,研究了該藻的不同組分分別對(duì)滸苔配子的影響,結(jié)果如圖5所示: 相關(guān)亞歷山大藻的五種組分均對(duì)滸苔配子的固著產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制,和對(duì)照相比均有顯著影響(P＜0.05)。其中藻液、藻細(xì)胞重懸液和去藻過濾液對(duì)配子的不利影響最為顯著,表明該抑制組分可能產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi),并且能分泌到細(xì)胞外。

2.3.2 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)去藻過濾液對(duì)滸苔配子固著的可能影響物質(zhì)分析 由圖6a可知,與室溫下(20°C)相關(guān)亞歷山大藻去藻過濾液的毒性相比,經(jīng)過不同溫度處理的去藻過濾液對(duì)滸苔配子固著的抑制作用均顯著減弱,表明溫度對(duì)過濾液毒性有一定的影響,去藻過濾液中可能含有易受溫度影響的蛋白類物質(zhì)。但是處理組與對(duì)照組滸苔配子固著量仍有顯著差異,說明該類物質(zhì)在高溫處理后亦可影響滸苔配子的固著,組成中還含有耐高溫的非蛋白成分。

圖5 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)不同組分對(duì)滸苔配子固著的影響效應(yīng)(*與對(duì)照組差異顯著P＜0.05)Fig.5 Effect of A.affine (ASCH)in different fractions on settlement of U.prolifera gametes (＊P＜0.05 as compared to the control)

與初始 pH(8.1)相比(圖6b),經(jīng)過酸堿處理的去藻過濾液對(duì)滸苔配子固著的影響有所降低,說明去藻過濾液中含有容易受到酸堿影響的成分。但是與對(duì)照組相比配子固著量仍顯著減少,說明過濾液中仍然含有耐酸堿的成分。由以上結(jié)果可知,影響滸苔配子固著的相關(guān)亞歷山大藻去藻過濾液中可能包含蛋白類和非蛋白類兩種成分。

與對(duì)照組相比(圖6c),去藻過濾液去除蛋白后,對(duì)滸苔配子固著的抑制效應(yīng)依然比較顯著。因此進(jìn)一步說明該類影響物質(zhì)含有非蛋白成分。

2.4 滸苔配子萌發(fā)階段抑制亞歷山大藻的可能影響效應(yīng)研究

由圖7可知,與對(duì)照組相比,滸苔配子添加組和滸苔濾液連續(xù)添加組均顯著抑制了塔瑪亞歷山大藻的生長(P＜0.05)。這說明滸苔配子可以分泌一些物質(zhì)來影響微藻的生長,且該抑藻物質(zhì)不但存在于滸苔組織中,還可以分泌到培養(yǎng)液中。

綜合以上結(jié)果得出: 滸苔配子在不同階段與亞歷山大藻間的相互作用關(guān)系不同。固著期主要體現(xiàn)在微藻對(duì)滸苔配子固著的抑制作用,這是亞歷山大藻通過分泌某些蛋白類和非蛋白類共同組成的化感物質(zhì)造成的,PSP毒素并未起到主導(dǎo)作用;萌發(fā)期主要體現(xiàn)在滸苔對(duì)微藻生長的抑制作用,是由滸苔配子分泌的化感物質(zhì)造成的。

圖6 相關(guān)亞歷山大藻(ASCH)去藻過濾液對(duì)滸苔配子固著的可能影響物質(zhì)分析(*與對(duì)照組差異顯著P＜0.05)Fig.6 Possible substance in A.affine (ASCH)cell-free medium on settlement of U.prolifera gametes (＊ P＜0.05 as compared to the control)

圖7 滸苔配子不同組分對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長的影響效應(yīng)分析(*對(duì)照組差異顯著P＜0.05)Fig.7 Effect of U.prolifera gametes in different fractions on growth of A.tamarense (ATHK)(＊P＜0.05 as compared to the control)

3 討論

我國黃海海域連年暴發(fā)大面積的滸苔綠潮,對(duì)近海生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的危害,而微藻作為海洋初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者,對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)平衡具有舉足輕重的作用。近年來人們提出利用大型藻藻華來抑制微藻藻華的理念。針對(duì)黃海滸苔綠潮對(duì)赤潮藻的影響效應(yīng),國內(nèi)的研究主要集中在滸苔多細(xì)胞成熟藻絲體的層面上,對(duì)作為滸苔形成早期階段的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較簡單的微觀繁殖體的影響研究尚有缺乏,因此本研究對(duì)滸苔微觀繁殖體(配子)在早期生長發(fā)育的不同時(shí)期與微藻間的相互作用關(guān)系進(jìn)行探討。研究發(fā)現(xiàn)滸苔配子在固著和萌發(fā)階段與微藻間的相互作用關(guān)系不同,兩者輪流體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)地位。固著期主要體現(xiàn)在微藻對(duì)滸苔配子固著的抑制作用,萌發(fā)期主要體現(xiàn)在滸苔對(duì)微藻生長的抑制作用。這種差異性可能與滸苔自身生長特性有關(guān): 固著期滸苔微觀繁殖體為裸露的單細(xì)胞,無細(xì)胞壁保護(hù),較脆弱,抵御外界環(huán)境能力稍弱;萌發(fā)期以后,細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞壁已形成,自身結(jié)構(gòu)較完整,抵御外界環(huán)境影響能力強(qiáng)(Christie,1973)。

首先在滸苔微觀繁殖體的固著階段,亞歷山大藻在生物量較低時(shí)(＜50cells/mL)就通過影響滸苔配子的存活而對(duì)其固著產(chǎn)生明顯的抑制;而滸苔對(duì)亞歷山大藻的生長無明顯的抑制或“殺死”作用。分析原因可能是亞歷山大藻分泌的化感物質(zhì)造成了這種效應(yīng),因?yàn)楸狙芯渴窃谑覂?nèi)控制條件下進(jìn)行,首先排除溫度、營養(yǎng)鹽變化等環(huán)境因素可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。光照雖然會(huì)造成配子固著的不均勻性,但是對(duì)其固著發(fā)育的生理狀況和最終固著量并沒有顯著地影響(Christie et al,1968)。就化感作用而言,利用PSP毒素對(duì)亞歷山大藻來說可能是最為有利的,然而通過對(duì)結(jié)果的分析比較,發(fā)現(xiàn)不同亞歷山大藻藻株對(duì)滸苔配子固著的影響效應(yīng)與所產(chǎn)毒素特征不符,不產(chǎn) PSP毒素的相關(guān)亞歷山大藻在生物量水平僅36cells/mL時(shí)就對(duì)滸苔配子的固著有明顯的抑制作用。因此,PSP毒素并非關(guān)鍵,除藻毒素之外的化感物質(zhì)可能發(fā)揮著積極作用。通過進(jìn)一步對(duì)相關(guān)亞歷山大藻培養(yǎng)液不同組分的比較,發(fā)現(xiàn)該影響物質(zhì)不但存在于藻細(xì)胞中而且可以分泌到胞外起到一定的作用,并且該類物質(zhì)可能由蛋白類和非蛋白類成分共同組成,所以亞歷山大藻細(xì)胞分泌的1種甚至幾種次生代謝物質(zhì)可能共同參與化感作用。而目前的一些研究均表明亞歷山大藻可以分泌多種化感物質(zhì)對(duì)其它藻類產(chǎn)生影響。Hansen等(1989),Tillmann等(2002)將其歸因于 PSP以外的未知毒素;Emura等(2004),Yamasaki等(2008)分別認(rèn)為是分子量＞10kDa的具有溶血活性的蛋白復(fù)合物和分子量大小為 1000kDa的多聚糖;張彬等(2008)發(fā)現(xiàn)相關(guān)亞歷山大藻能產(chǎn)生極性多糖類毒素;Ma等(2011)得出亞歷山大藻的化感物質(zhì)至少包含兩部分具有不同極性的成分,其中一部分組成為分子量在 7—15kDa間的非蛋白成分,但具體化學(xué)結(jié)構(gòu)未知。這些研究報(bào)道的亞歷山大藻藻株分泌化感物質(zhì)的特性與本研究結(jié)果相吻合,同時(shí)也為下一步特異性的針對(duì)抑制滸苔的化感物質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定奠定了基礎(chǔ),也許將來可以實(shí)現(xiàn)選擇性的抑制滸苔的生長發(fā)育,從而為滸苔綠潮的減災(zāi)政策提供理論依據(jù)。

在隨后滸苔的萌發(fā)階段,兩者間相互作用主要體現(xiàn)在滸苔對(duì)亞歷山大藻生長的抑制: 滸苔配子添加組在其完全萌發(fā)的第 7天對(duì)塔瑪亞歷山大藻的生長抑制率達(dá)到了27%,明顯影響了其生長,并且連續(xù)添加的培養(yǎng)濾液也對(duì)塔瑪亞歷山大藻的生長產(chǎn)生了顯著的抑制。王悠等(2006)指出細(xì)菌可能會(huì)影響環(huán)境中微藻的生長及種群動(dòng)態(tài)。然而本實(shí)驗(yàn)的滸苔經(jīng)過滅菌處理,環(huán)境細(xì)菌對(duì)微藻生長的影響基本可以忽略。另外本研究排除了光照、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因素的影響,結(jié)合滸苔成熟藻絲體的研究,推斷是滸苔微觀繁殖體分泌的化感物質(zhì)造成了這種效應(yīng),進(jìn)一步說明滸苔在早期發(fā)育過程中就已經(jīng)開始分泌化感物質(zhì),而并不僅僅局限于成熟藻絲體階段(霍元子等,2010;張建恒等,2011;賈睿等,2012;Wang et al,2013)。

結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于滸苔化感作用的研究結(jié)果以及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),微藻對(duì)滸苔的抑制作用只體現(xiàn)在滸苔微觀繁殖體的固著階段,而滸苔對(duì)微藻的競爭優(yōu)勢(shì)從早期的萌發(fā)階段到逐漸發(fā)育成熟的藻絲體階段都有所體現(xiàn),如果這種相互作用在自然界發(fā)生,其生態(tài)效應(yīng)是復(fù)雜的。倘若作為綠潮發(fā)生“種子庫”的大量微觀繁殖體在最初的固著過程中未被亞歷山大藻抑制,那么在隨后生長發(fā)育階段滸苔逐漸開始占據(jù)優(yōu)勢(shì): 首先在萌發(fā)階段便開始分泌化感物質(zhì)抑制微藻生長;然后滸苔逐漸生長發(fā)育,并在合適的風(fēng)場流場作用下逐漸向北漂移,漂移過程中在合適的光照溫度等條件下生物量迅速擴(kuò)增,繼而通過遮蔽陽光、分泌化感物質(zhì)以及大量吸收營養(yǎng)鹽等途徑,進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)微藻的抑制作用,這一過程從現(xiàn)場調(diào)查和試驗(yàn)研究中可以得到明顯的體現(xiàn)(夏斌等,2009;霍元子等,2010;秦玉濤等,2011)。然而,在個(gè)別河口也可能存在生物量較高的亞歷山大藻,一旦它們從最初固著階段對(duì)滸苔微觀繁殖體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用,便可從早期階段抑制滸苔的生長發(fā)育繼而影響綠潮的發(fā)生發(fā)展過程。因此,滸苔微觀繁殖體與微藻之間的化感作用很可能通過影響滸苔的生長發(fā)育,進(jìn)而密切影響綠潮的發(fā)生規(guī)模;同時(shí)滸苔綠潮對(duì)黃海海域微型浮游植物的影響也并不局限于成熟的藻絲體階段,而是從發(fā)育早期的萌發(fā)階段就開始體現(xiàn),這種潛在的危害效應(yīng)值得深入評(píng)估。

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