唐文帥，廖 麗，趙樹林，廖祥麗，鐘前進(jìn)，胡義杰，許紅霞 (.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所營(yíng)養(yǎng)科，重慶40004;.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管外科，重慶40004)

體外循環(huán)心臟手術(shù)雖然采用了溫度控制、高鉀心臟停搏液等多種方式來(lái)減輕心肌損傷，但心肌缺血再灌注損傷是體外循環(huán)心臟手術(shù)后發(fā)生心功能衰竭的重要的原因之一［1］。JAK/STAT 信號(hào)通路調(diào)控以及自噬途徑的調(diào)節(jié)是心肌缺血再灌注損傷各種機(jī)制研究的關(guān)鍵點(diǎn)。盡管已有研究報(bào)道了多種預(yù)處理措施來(lái)改善心肌缺血再灌注損傷，如心肌缺血預(yù)處理、AG490 調(diào)節(jié)JAK/STAT 信號(hào)通路、雷帕霉素(rapamycin)上調(diào)心肌細(xì)胞自噬等［2］，但仍有諸多問題尚需闡明。一方面，這些不同機(jī)制的預(yù)處理措施心肌保護(hù)效果的差異尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，且多種保護(hù)機(jī)制之間是否存在相互作用尚無(wú)定論。另一方面，關(guān)于JAK/STAT 信號(hào)通路抑制劑AG490 的作用效果文獻(xiàn)報(bào)道不一，是否可能存在其他非JAK/STAT 的信號(hào)通路機(jī)制參與其作用未見報(bào)道。本研究擬在成年SD 大鼠Langendorff 離體心臟灌注模型中比較不同預(yù)處理措施的心肌保護(hù)效果，進(jìn)而比較各組JAK/STAT 信號(hào)通路和心肌自噬相關(guān)蛋白水平，探討不同心肌保護(hù)措施時(shí)JAK/STAT 和心肌自噬間可能作用的復(fù)雜機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 Langendorff 離體心臟灌注模型

由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供6 月齡清潔級(jí)SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200 ～250 g。SD 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)麻醉后，固定于動(dòng)物臺(tái)上開腹并經(jīng)下腔靜脈注射肝素生理鹽水(3 mg/kg)后，迅速開胸切取心臟，并將其置于95%O2和5%CO2混合氣體平衡過的無(wú)鈣冷灌流液(Krebs-Henseleit，KH)中。經(jīng)主動(dòng)脈插管逆行灌注于Langendorff 離體灌注裝置(埃德公司，澳大利亞)上，以10 mL/min流量的KH 液行離體心臟灌注，灌注壓力60 mmHg 以上。離體心臟平衡灌注20 min 后，心率(heart rate，HR)超過200 次/分，且左室收縮壓大于60 mmHg，方能行后續(xù)心臟缺血再灌注實(shí)驗(yàn)，未滿足上述條件的心臟應(yīng)舍棄不用。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

20 只SD 大鼠根據(jù)不同預(yù)處理方式隨機(jī)分為4 組(圖1):對(duì)照組、缺血預(yù)處理組、AG490 預(yù)處理組和Rapamycin 預(yù)處理組。①對(duì)照組(5 只):SD 大鼠先以已平衡過的KH 液灌注30 min，停灌30 min，再恢復(fù)KH 液灌注30 min，模擬心肌缺血再灌注過程。②缺血預(yù)處理組(5 只):SD 大鼠先以已平衡過KH 液灌注20 min，然后停灌注5 min，復(fù)灌5 min，重復(fù)3 次，模擬缺血預(yù)處理。再停灌30 min，再恢復(fù)KH 液灌注30 min。③AG490預(yù)處理組(5 只):SD 大鼠先用已平衡過的KH 液灌注20 min，再給予KH 液+AG490(5 uM，Sigama 公司，美國(guó))灌注10 min，停灌30 min，再恢復(fù)KH 液灌注30 min。④Rapamcin 預(yù)處理組(5 只):SD 大鼠先用已平衡過的KH 液灌注20 min，再給予KH 液+Rapamycin(終濃度200 nM，漢恒生物公司)灌注10 min，停灌30 min，再恢復(fù)KH 液灌注30 min。

Langendorff 離體心臟灌流系統(tǒng)自帶的Powerlab 系統(tǒng)記錄心臟功能相關(guān)數(shù)據(jù)。與本研究相關(guān)的心臟缺血再灌注后心臟功能相關(guān)指標(biāo)包括:左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓上升最大變化速率(Max Dp/dt)、等容舒張期左心室內(nèi)壓下降最大變化速率(Min Dp/dt)。心臟缺血再灌注過程結(jié)束后，一部分心臟標(biāo)本立即凍存于液氮，備后續(xù)蛋白分析;另一部分心臟標(biāo)本采用10%中性甲醛固定并石蠟包埋，備后續(xù)的組織損傷評(píng)價(jià)。

圖1 預(yù)處理干預(yù)的Langendorff 離體心臟灌注流程

1.3 心肌組織損傷評(píng)價(jià)

用TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL Apoptosis Assay Kit，Roche，美國(guó))檢測(cè)心肌組織凋亡水平。采用Image Pro Plus 7.0 軟件記錄DAPI 細(xì)胞核染色和TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。取3 個(gè)隨機(jī)視野的平均值來(lái)計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡的比例。

1.4 Western-blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白水平

抽提心肌組織的總蛋白后，BCA 法檢測(cè)總蛋白濃度。10%SDS-PAGE 膠電泳，電轉(zhuǎn)PVDF 膜，封閉后加anti-STAT3 抗體、anti-p-STAT3 抗體、anti-LC3 抗體和anti-LAMP2 抗體及對(duì)應(yīng)的二抗免疫印跡檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)，內(nèi)參采用β-actin。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較組間差異，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各預(yù)處理措施后心臟血液動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)比較

缺血預(yù)處理組、AG490 預(yù)處理組、Rapamycin 預(yù)處理組的LVDP、Max Dp/dt、Min Dp/dt 均顯著優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。3 種預(yù)處理措施之間比較，AG490 預(yù)處理組與Rapamycin 預(yù)處理組的Max Dp/dt 和Min Dp/dt 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但AG490 預(yù)處理組與缺血預(yù)處理、Rapamycin 預(yù)處理與缺血預(yù)處理之間無(wú)顯著差異(表1)。提示3種預(yù)處理措施均有改善心肌缺血再灌注損傷的效果，AG490 預(yù)處理組效果與缺血預(yù)處理組相當(dāng)，但優(yōu)于Rapamycin 預(yù)處理組。

表1 各組預(yù)處理措施后心臟血液動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)比較

2.2 各預(yù)處理措施后心肌損傷程度比較

各預(yù)處理措施后心肌組織的平均凋亡率:對(duì)照組47%、缺血預(yù)處理組18%、AG490 預(yù)處理組24%和Rapamycin 預(yù)處理組20%(圖2)，提示缺血預(yù)處理組、AG490 預(yù)處理組和Rapamycin預(yù)處理組心肌組織凋亡水平均低于對(duì)照組。3 種預(yù)處理措施在心肌凋亡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各預(yù)處理后STAT3 及其磷酸化水平、自噬相關(guān)蛋白水平的比較

考慮到JAK/STAT3 信號(hào)通路中STAT3 及其磷酸化水平、自噬水平的在預(yù)處理機(jī)制中的重要作用，我們比較了上述2 種機(jī)制的相關(guān)蛋白水平。從JAK/STAT 信號(hào)通路方面來(lái)看，缺血預(yù)處理組STAT3 水平最高，AG490 組和Rapamycin 組其次，但均高于對(duì)照組水平;AG490 組p-STAT3 水平明顯低于缺血預(yù)處理組和Rapamycin 預(yù)處理組，接近對(duì)照組(圖3)，提示AG490預(yù)處理后STAT3 的磷酸化水平并不高于對(duì)照組，其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制可能并非通過經(jīng)典的JAK/STAT信號(hào)作用途徑實(shí)現(xiàn)。從心肌自噬角度來(lái)看，Rapamycin 組LC3 水平最高，缺血預(yù)處理組和AG490 組接近，但均顯著高于對(duì)照組。而代表心肌自噬溶酶體功能的LAMP2 水平，在缺血預(yù)處理組最強(qiáng)，Rapamycin 預(yù)處理和AG490 預(yù)處理組其次，但均顯著高于對(duì)照組(圖3)，提示AG490 預(yù)處理提高了心肌的自噬水平，部分自噬標(biāo)志物水平與缺血預(yù)處理和Rapamycin 預(yù)處理組接近。

圖2 各組預(yù)處理措施后心肌細(xì)胞凋亡分析(×400)

圖3 各組預(yù)處理措施后心肌組織蛋白水平分析

3 討論

既往研究認(rèn)為，JAK/STAT3 信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用［3-5］。在缺血階段，STAT3 通過磷酸化而活化;在再灌注階段，STAT3 的磷酸化進(jìn)一步增加;STAT3 的磷酸化能減輕心肌細(xì)胞的死亡。目前公認(rèn)能有效減輕心肌缺血再灌注損傷的措施——缺血預(yù)處理或缺血后處理，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，必須依賴STAT3 且其效果與STAT3 磷酸化水平有關(guān)?；罨腟TAT3 不僅可以減輕缺血再灌注對(duì)線粒體的損傷，減少氧自由基的釋放［6］，也能影響其下游的多個(gè)發(fā)揮心肌保護(hù)作用靶基因表達(dá)，特別是發(fā)揮清除氧自由基作用的錳超氧化物岐化酶表達(dá)［7-8］。各種預(yù)處理措施對(duì)JAK/STAT3 信號(hào)通路的影響不同，其心肌保護(hù)效果可能存在差異。

事實(shí)上，JAK 特異性酪氨酸激酶抑制劑AG490，作為預(yù)處理措施時(shí)，其效果和可能的作用機(jī)制目前尚存爭(zhēng)議。AG490 能有效抑制STAT3 磷酸化，常常作為JAK/STAT3 信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究的干預(yù)措施;其阻斷STAT3 會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡水平增加［9］。但Hwang 等［10］和我們的研究均顯示AG490 預(yù)處理能有效減輕心肌缺血再灌注損傷;且其離體心臟保護(hù)效果接近Rapamycin 和缺血預(yù)處理。此外，當(dāng)AG490 和缺血預(yù)處理同時(shí)給予時(shí)，缺血預(yù)處理的效果也消失［11］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，AG490 預(yù)處理后，STAT3 磷酸化水平顯著低于缺血預(yù)處理和Rapamycin 預(yù)處理，與正常對(duì)照組相當(dāng)。這些現(xiàn)象提示AG490 預(yù)處理發(fā)揮作用的機(jī)制可能并非通過經(jīng)典的JAK/STAT 信號(hào)作用途徑實(shí)現(xiàn)。

基于這一特殊現(xiàn)象，我們對(duì)與JAK/STAT 信號(hào)通路相關(guān)，且在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用的自噬過程進(jìn)行了進(jìn)一步的對(duì)比觀察和機(jī)制分析。觀察到AG490 預(yù)處理能影響發(fā)揮心肌保護(hù)作用的另一重要過程——心肌自噬［12］，部分自噬標(biāo)志物水平與缺血預(yù)處理和Rapamycin 預(yù)處理組接近。其可能機(jī)制包括:一方面，非致命性的AG490 損害激發(fā)心肌細(xì)胞動(dòng)員其他機(jī)制誘導(dǎo)了自噬等預(yù)處理保護(hù)作用。其作用方式類似于缺血預(yù)處理措施，但我們的結(jié)果顯示其效果不亞于缺血預(yù)處理。有研究認(rèn)為，抑制STAT3 能通過電子呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ降低線粒體ATP 產(chǎn)生從而刺激ROS 的生成，促進(jìn)自噬的發(fā)生;且增高的ROS 卻可以活化STAT3，形成STAT3 的自反饋機(jī)制［13］。另一方面，最新研究顯示抑制STAT3 能上調(diào)細(xì)胞自噬。Shen等［14］和Jonchere 等［15］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿內(nèi)STAT3 能通過抑制PKR 活性來(lái)抑制自噬;而抑制STAT3 能刺激自噬流的水平。因此，類似于缺血后處理在不同模型、不同干預(yù)階段而存在不同調(diào)節(jié)機(jī)制的現(xiàn)象［16］，AG490 預(yù)處理能減輕后續(xù)的心肌缺血再灌注損傷，但其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制可能與具體的干預(yù)環(huán)節(jié)有關(guān)系。

總之，本研究通過比較缺血預(yù)處理、AG490 預(yù)處理和Rapamycin 預(yù)處理3 種措施，發(fā)現(xiàn)AG490 預(yù)處理對(duì)成年大鼠心肌保護(hù)效果與缺血預(yù)處理、Rapamycin預(yù)處理相當(dāng)，其機(jī)制可能并非通過經(jīng)典的JAK/STAT信號(hào)作用途徑實(shí)現(xiàn)，而可能與其誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬相關(guān)。

［1］Ibanez B，Heusch G，Ovize M，et al.Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.J Am Coll Cardiol，2015，65(14):1454 －1471.

［2］沈 誠(chéng)，陳建明，胡義杰，等.STAT3 介導(dǎo)缺血后處理心肌保護(hù)作用的研究［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2013，22(6):631 －634.

［3］Zhuo C，Wang Y，Wang X，et al.Cardioprotection by ischemic postconditioning is abolished in depressed rats:role of Akt and signal transducer and activator of transcription-3［J］.Mol Cell Biochem，2011，346(1 －2):39 －47.

［4］Boengler K，Buechert A，Heinen Y，et al.Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in aged and STAT3-deficient mice［J］.Circ Res，2008，102(1):131 －135.

［5］Bolli R，Dawn B，Xuan YT.Role of the JAK-STAT pathway in protection against myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Trends Cardiovasc Med，2003，13(2):72 －79.

［6］Yang Y，Duan W，Jin Z，et al.JAK2/STAT3 activation by melatonin attenuates the mitochondrial oxidative damage induced by myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.J Pineal Res，2013，55(3):275 －286.

［7］Barry SP，Townsend PA，Latchman DS，et al.Role of the JAK-STAT pathway in myocardial injury［J］.Trends Mol Med，2007，13(2):82 －89.

［8］Goodman MD，Koch SE，Afzal MR，et al.STAT subtype specificity and ischemic preconditioning in mice:is STAT-3 enough?［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(2):522 －526.

［9］Kunisada K，Negoro S，Tone E，et al.Signal transducer and activator of transcription 3 in the heart transduces not only a hypertrophic signal but a protective signal against doxorubicin-induced cardiomyopathy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(1):315 －319.

［10］Hwang YC，Shaw S，Kaneko M，et al.Aldose reductase pathway mediates JAK-STAT signaling:a novel axis in myocardial ischemic injury［J］.FASEB J，2005，19(7):795 －797.

［11］Hattori R，Maulik N，Otani H，et al.Role of STAT3 in ischemic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33(11):1929 －1936.

［12］Gatica D，Chiong M，Lavandero S，et al.Molecular mechanisms of autophagy in the cardiovascular system［J］.Circ Res，2015，116(3):456 －467.

［13］Boengler K，Ungefug E，Heusch G，et al.The STAT3 inhibitor stattic impairs cardiomyocyte mitochondrial function through increased reactive oxygen species formation［J］.Curr Pharm Des，2013，19(39):6890 －6895.

［14］Shen S，Niso-Santano M，Adjemian S，et al.Cytoplasmic STAT3 represses autophagy by inhibiting PKR activity［J］.Mol Cell，2012，48(5):667 －680.

［15］Jonchere B，Belanger A，Guette C，et al.STAT3 as a new autophagy regulator［J］.JAKSTAT，2013，2(3):e24353.

［16］Barsukevich V，Basalay M，Sanchez J，et al.Distinct cardioprotective mechanisms of immediate，early and delayed ischaemic postconditioning［J］.Basic Res Cardiol，2015，110(1):452.