李維峰++王婭玲++黃艷麗++高云濤

摘 要 利用超聲耦合乙醇-硫酸銨雙水相萃取技術(shù)提取牛大力總黃酮。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響牛大力總黃酮提取的料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時(shí)間等因素進(jìn)行探討，以建立牛大力總黃酮的提取工藝。結(jié)果顯示：影響牛大力總黃酮提取因素的主次順序?yàn)榱弦罕?乙醇濃度>硫酸銨濃度>超聲時(shí)間；最優(yōu)提取條件為乙醇濃度80%、料液比1∶40（m∶V）、超聲時(shí)間50 min、硫酸銨濃度為0.3 g/mL，在此條件下，牛大力總黃酮得率為5.82 mg/g。

關(guān)鍵詞 雙水相 ；牛大力 ；總黃酮 ；超聲耦合

分類號(hào) R284.2

牛大力（Millettia Specisoa Champ.），別名山蓮藕、大力薯、金鐘根、豬腳笠，為豆科植物崖豆藤屬植物美麗崖豆的塊根，具有清熱止咳、舒筋活絡(luò)、補(bǔ)肺滋陰等功效，用于治療腎虛、跌打損傷、慢性肝炎、肺虛咳嗽等[1]。相關(guān)研究表明，牛大力中富含揮發(fā)油、黃酮、木脂素、多糖等活性成分[2-5]，但關(guān)于牛大力中總黃酮化合物的提取研究報(bào)道較少[6]。

雙水相提取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，是利用物質(zhì)在互不相容的兩相中分配系數(shù)的不同來進(jìn)行提取分離的方法[7]，傳統(tǒng)聚合物與無機(jī)鹽形成的雙水相體系因?yàn)榫酆衔镎扯容^大，導(dǎo)致成本較高，提取物的后續(xù)處理比較困難等缺點(diǎn)，最近發(fā)展由低級(jí)醇如乙醇、丙醇與鹽組成雙水相體系[8-10]，該法具有提取分離條件溫和、過程易于應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)、生物適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物提取、天然產(chǎn)物分離、食品化工等行業(yè)[11-14]。本研究擬采用超聲耦合乙醇-水-硫酸銨雙水相提取牛大力總黃酮，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為牛大力中總黃酮的提取開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

牛大力飲片（廣州南北行中藥飲片有限公司）采購自廣東省河源市，干燥后粉碎過40目篩，冷藏備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；其他試劑均為國藥集團(tuán)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器

北京中興偉業(yè)FW-200萬能粉碎機(jī)；上?？茖?dǎo)SK5210HP超聲清洗儀，上海精科UV759紫外-可見分光光度計(jì)；梅特勒AL204電子分析天平；上海一恒DZF-6053真空干燥箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系制備

在硫酸銨溶液加入一定濃度的無水乙醇，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，并通過改變成相后乙醇的濃度和硫酸銨的濃度控制雙水相體系的組成[15]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總黃酮含量的測定采用分光光度法，配制0.2 mg/mL蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于25 mL比色管中，加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[16]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.012 5x-0.003 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.2.3 樣品總黃酮的提取

取1 g牛大力干粉于100 mL圓底燒瓶中，按照超聲功率500 W，超聲溫度60℃[6]，分別研究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、不同硫酸銨濃度（0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 g/mL）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)牛大力總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸提料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時(shí)間4個(gè)因素按照L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)（見表1）。

1.2.5 樣品總黃酮的分析

取1 mL牛大力提取液，于25 mL比色管中，加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[16]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長處測定吸光度，利用回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量，并按照下面公式計(jì)算總黃酮得率。

總黃酮得率（%）=（提取液中總黃酮質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)提取的影響

由圖1可以看出，料液比直接影響牛大力總黃酮的得率，料液比過大或者過小都不利于總黃酮的提取，料液比過小，溶劑體積過少，黃酮類從樣品擴(kuò)散到溶劑中的速率低，而且極易達(dá)到飽和狀態(tài)；料液比過大，不但會(huì)在加熱過程中造成能源的浪費(fèi)，更會(huì)因溶劑用量過多，硫酸銨用量增大，影響雙水相的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降，因此選用1∶30（m∶V）為最佳料液比。

2.1.2 硫酸銨用量對(duì)提取的影響

從圖2可以看出，隨著硫酸銨用量的增加，總黃酮得率先上升后下降，在0.3 g/mL時(shí)達(dá)到最大值，總黃酮得率為0.557%。究其原因，可能是因?yàn)榱蛩徜@在0.3 g/mL時(shí)形成的雙水相最為穩(wěn)定，有利于黃酮的溶出和擴(kuò)散。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)提取的影響

乙醇濃度會(huì)影響雙水相的組成及穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)總黃酮得率產(chǎn)生影響。從圖3可以看出，乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮得率最高，達(dá)到5.72mg/g，過低的醇濃度不利于黃酮類化合物從植物細(xì)胞中溶解出來，而過高的醇濃度不易透過親水性植物細(xì)胞壁。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)提取的影響

從圖4可以看出，超聲時(shí)間10～40 min總黃酮得率隨超聲時(shí)間的延長而提高，在40 min時(shí)達(dá)到最大值，之后繼續(xù)超聲提取得率會(huì)有所降低，可能是超聲時(shí)間過長，黃酮類化合物部分氧化降解，從而導(dǎo)致提取得率下降，所以選定40 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 牛大力總黃酮提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以牛大力總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，牛大力總黃酮的提取得率受到超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、硫酸銨濃度4個(gè)因素的交叉影響，通過極差R值的比較可以看出，影響牛大力總黃酮提取得率因素的主次順序?yàn)榱弦罕?gt;乙醇濃度>硫酸銨濃度>超聲時(shí)間，牛大力總黃酮的超聲輔助雙水相提取最佳條件是A3B2C3D3，即料液比為1∶40（g/mL），硫酸銨濃度為0.3 g/mL，超聲提取時(shí)間為50 min，乙醇濃度為60%。

2.3 最佳條件組合試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，按照乙醇濃度為80%，硫酸銨濃度為0.3 g/mL配制雙水相溶液，料液比為1∶40（g/mL），超聲提取時(shí)間為50 min，牛大力總黃酮進(jìn)行5次平行提取試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可見，在上述最佳提取工藝下，采用超聲耦合乙醇-硫酸銨雙水相提取牛大力總黃酮，平均得率為5.82 mg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均標(biāo)準(zhǔn)誤（RSD）為1.02%。與前人研究中超聲輔助乙醇溶液提取牛大力總黃酮方法相比，得率有明顯的提高[6]。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將超聲提取與乙醇-硫酸銨雙水相分離技術(shù)耦合集成，研究了牛大力中總黃酮的提取最佳工藝，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證最佳工藝下總黃酮的得率，發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為80%、硫酸銨濃度為0.3 g/mL配制雙水相溶液、料液比為1∶40（g/mL）、超聲提取時(shí)間為50 min的條件下，牛大力總黃酮平均得率可以達(dá)到5.82 mg/g，該工藝耗時(shí)短，提取工藝簡單，比超聲輔助單純乙醇溶液提取黃酮的得率明顯要高，具有很高的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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