鐘桂芳，樊 攀，毛多斌

(1.鄭州輕工業(yè)學院，河南鄭州450002;2.江蘇九旭藥業(yè)有限公司，江蘇徐州221200)

蘆薈的主要活性成分是蘆薈大黃素，該成分具有抗腫瘤、抗菌、免疫抑制和瀉下作用，還具有降脂減肥和去屑光澤頭發(fā)等功效［1］。該化合物是制備治療關節(jié)炎藥物雙醋瑞因的重要原料［2］。蘆薈苷是C-C糖苷鍵，非常穩(wěn)定，是所有糖苷鍵中最難水解的，這一特性制約了蘆薈苷轉化為蘆薈大黃素，成為世界性難題。國際上通常采用化學法來斷裂該鍵，這些方法的缺陷是使用了金屬試劑，或其他有害或有毒物質，并且需要復雜的純化工藝，以去除上述的殘留物［3-6］。

河南省為蘆薈種植大省，但目前蘆薈加工產品依然停留在蘆薈原汁和干粉上，產品的附加值較低。本研究采用生物酶法有效地水解蘆薈苷C-C糖苷鍵，制備蘆薈大黃素，為蘆薈大黃素的大規(guī)模的生物法制備奠定基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

蘆薈苷及蘆薈大黃素標準品，購買自SIGMA公司;蘆薈大黃素樣品1mg實驗室制備;葡萄糖苷酶，鄭州輕工業(yè)學院生物催化與轉化實驗室制備;Waters高效液相色譜系統;XTerra MS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);Waters 1525型紫外檢測器;Waters 2487型高壓恒流泵;檢測波長254 nm;流動相:V(甲醇)∶V(0.1%乙酸水溶液)=80∶20;進樣量10 μL;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:30 ℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆薈大黃素標準曲線 精確稱取蘆薈大黃素標準品50.0 mg，加入適量乙酸乙酯，超聲10 min促使溶解，冷卻后，以甲醇定容至50 mL，配制成1 g·L-1的標準溶液。然后配制成質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g·L-1的梯度標準溶液。

1.2.2 重組葡萄糖糖苷酶水解蘆薈苷合成蘆薈大黃素 稱取蘆薈苷5 g，放入500 mL圓底燒瓶內，依次加入65 mL醋酸緩沖液(20 mmol·L-1，pH值5.2)，30 mL叔丁醇和5 mL重組葡萄糖苷酶粗酶液，在50℃、150 r·min-1條件下反應4 h。反應液經用HPLC和TLC檢測。蘆薈大黃素轉化率計算公式如下:

1.2.3 蘆薈大黃素的分離純化 反應液在60℃條件下真空干燥，經索氏提取后，5℃放置結晶，抽濾后，濾餅以10 mL甲苯洗滌2次，該洗滌液60℃真空干燥得蘆薈大黃素粗品。將濃縮的蘆薈大黃素甲苯溶液加入硅膠柱中，乙酸乙酯洗脫。將含有蘆薈大黃素的洗脫液合并后，減壓濃縮得棕黃色的殘渣。用薄層層析和高效液相色譜等檢測蘆薈大黃素純度。

1.2.4 各試驗因素對蘆薈大黃素轉化的影響 根據蘆薈大黃素的合成方法，分別在 1、2、4、6、8、10、12 h時間取樣檢測，考察反應時間對蘆薈大黃素轉化的影響;調整加酶量，分別在體積酶活性為40、45、50、55、60 U·mL-1條件下進行合成試驗，考察體積酶活性對蘆薈大黃素轉化的影響;調整底物質量濃度，分別在蘆薈苷質量濃度為50、75、100、125、150 g·L-1時合成試驗，考察蘆薈苷質量濃度對蘆薈大黃素轉化的影響;考察叔丁醇與水的體積比對蘆薈大黃素轉化的影響，分別在叔丁醇和水的體積比為 1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1 條件下進行合成試驗;考察反應溫度對蘆薈大黃素轉化的影響，分別在30、40、50、60、70 ℃等下進行合成試驗;考察pH值對蘆薈大黃素轉化的影響，分別在pH值為 3.6、4.2、5.2、6.2、7.2、8.0 時進行試驗。

1.2.5 響應曲面試驗 根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken模型，以蘆薈大黃素的質量百分濃度為響應值，以反應時間(X1)、叔丁醇體積分數(X2)、反應溫度(X3)作為影響類蘆薈大黃素合成的主要因素，通過響應面分析進行進一步優(yōu)化，水平編碼見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結果與分析

2.1 反應時間對蘆薈大黃素合成的影響

由圖1可知，反應時間對蘆薈大黃素的合成有很大影響。在前4 h內，隨著時間的延長，蘆薈大黃素轉化率呈增加的趨勢，最高轉化率達84.58%;當反應時間超過4 h之后，蘆薈大黃素轉化率基本維持在80%左右。因此，為保證蘆薈大黃素的產量和工作效率，選擇4 h作為最適反應時間。

圖1 反應時間對蘆薈大黃素合成的影響Fig.1 Effects of reaction time on the synthesize of Aloe-emodin

2.2 酶濃度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖2可知，在一定范圍內，蘆薈大黃素轉化率與重組葡萄糖苷酶體積酶活性呈正相關關系。隨著體積酶活性的增加，蘆薈大黃素轉化率不斷增大，蘆薈大黃素的最大轉化率為86.21%，當體積酶活性大于50 U·mL-1時，蘆薈大黃素轉化率變化不大。

圖2 酶濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.2 Effects of enzyme＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.3 蘆薈苷質量濃度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖3可知，當蘆薈苷質量濃度較低時，即低于100 g·L-1時，蘆薈大黃素轉化率變化不大，基本在80%左右。蘆薈苷在低質量濃度下，蘆薈大黃素轉化率較高，這是由于底物濃度低，葡萄糖苷酶水解速率較快，所以轉化率偏高;當蘆薈苷質量濃度高于100 g·L-1時，蘆薈大黃素轉化率迅速下降，由于葡萄糖苷酶的量有限，且達到最大水解速率，底物雖然增加，但蘆薈大黃素的產量不會隨之增加，因此呈下降趨勢?？紤]到實際生產意義，選擇蘆薈苷質量濃度為100 g·L-1作為最適底物質量濃度。

圖3 蘆薈苷質量濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.3 Effects of Aloin＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.4 叔丁醇與水的體積比對蘆薈大黃素合成的影響

由圖4可知，叔丁醇對葡萄糖苷酶水解蘆薈苷影響較大，可能是由于叔丁醇和水以一定比例混合時，蘆薈苷的溶解性較好，有利于蘆薈苷的水解。當V(叔丁醇)∶V(水)=5∶5時，蘆薈大黃素轉化率最高，為84.09%。當叔丁醇含量降低時，由于蘆薈苷溶解度下降，蘆薈大黃素轉化率降低;當叔丁醇含量較高時，叔丁醇會影響葡萄糖苷酶活力，使其活力降低，導致蘆薈大黃素轉化率降低。

圖4 叔丁醇濃度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.4 Effects of tert-butanol＇s concentration on the synthesize of Aloe-emodin

2.5 溫度對蘆薈大黃素合成的影響

由圖5可知，在一定范圍內，當反應溫度低于50℃時，蘆薈大黃素轉化率隨著溫度的增高而增大。反應溫度為50℃時，蘆薈大黃素轉化率最大，為85.78%，當反應溫度大于50℃時，蘆薈大黃素轉化率迅速降低。可能的原因是，一方面，由于反應溫度較高，酶蛋白發(fā)生變性，導致酶活力喪失，影響蘆薈苷的水解，從而使蘆薈大黃素轉化率下降。

圖5 溫度對蘆薈大黃素合成的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on the synthesize of Aloe-emodin

2.6 pH值對蘆薈大黃素合成的影響

由圖6可知，當 pH 值在3.6～5.2，蘆薈大黃素轉化率逐漸增大，說明該葡萄糖苷酶不耐酸，在強酸條件下，該酶蛋白發(fā)生變性，致使蘆薈大黃素轉化率較低;當pH值為5.2時，蘆薈大黃素轉化率最大，為 85.08%，當 pH 值在 5.2 ～8.0，蘆薈大黃素轉化率變化不大，說明該重組葡萄糖苷酶適宜在弱酸和弱堿性條件下反應，具有廣泛的pH值適應性。

圖6 pH值對蘆薈大黃素合成的影響Fig.6 Effects of pH on the synthesis of Aloe-emodin

2.7 響應曲面試驗

利用Design Expert 7.1軟件對試驗因素和水平進行設計，并通過試驗得到各自的蘆薈大黃素轉化率，結果如表2。通過Design Expert 7.1軟件進行回歸分析，得到蘆薈大黃素轉化率和各影響因素之間的回歸方程。擬合后得到反應時間(X1)、叔丁醇與水的體積比(X2)、反應溫度(X3)的二次回歸模型為:

表2 響應面設計方案與試驗結果Table 2 The design of response surface methodology and the results of test

由試驗因素與水平設計，共進行了17次試驗，可分為析因子和零點，其中析因子共有12個，零點為區(qū)域中心，共有5個，用來估計試驗誤差。

由回歸分析方差表3可知，模型決定系數R2為0.999 6，F 值為1 302.38(P ＜0.000 1)，說明此模型極顯著，反應時間(X1)、叔丁醇與水的體積比(X2)、反應溫度(X3)對蘆薈苷水解效應顯著。Lack of Fit值為0.11，即方程擬合度很高。信噪比Adeq Precision的值很高(為107.19)，即該模型可用于預測，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳糖苷合成條件。CV值 (即Y的變異系數)表示試驗的精確度，CV值越高，則試驗的可靠性越低，本試驗中CV值為1.11%，比較低，表明試驗操作可靠。因此，該回歸方程可確定蘆薈大黃素的最佳合成工藝條件?；貧w模型方差分析(表4)中一次項 X1，X2，X3，二次項和交互項 X1X2，對模型均影響顯著，說明各因素對糖苷合成不是簡單的線性關系。

由回歸方程可分別得出反應時間(X1)、叔丁醇濃度(X2)、反應溫度(X3)3因素與蘆薈大黃素轉化率之間的響應面圖，如圖7所示。由圖7可知反應時間(X1)、叔丁醇與水體積比(X2)對蘆薈大黃素的合成影響較顯著，且各因素之間交互作用明顯，與方差分析結果一致。

運用Design Expert 7.1軟件，通過回歸方程得到蘆薈大黃素最佳合成工藝條件是:反應時間為4 h，V(叔丁醇)∶V(水)=3.5∶6.5，反應溫度為 43℃，蘆薈大黃素轉化率90.80%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

表4 回歸分析方差表Table 4 Table of regression analysis of variance

圖7 反應時間和叔丁醇與水體積比對蘆薈大黃素轉化率的影響Fig.7 The interaction effection of reaction time tert-butanol’s concentration

3 驗證試驗及其結果

稱取蘆薈苷10 g放入500 mL圓底燒瓶內，依次加65 mL乙酸緩沖液(20 mmol·L-1，pH值5.2)，35 mL叔丁醇和5 mL β-葡萄糖苷酶粗酶液(50 μ·mL-1)，在 43 ℃，100 r·min-1條件下反應4 h，重復2次。反應結束后，經高效液相色譜法測得蘆薈大黃素轉化率分別為89.06%，89.42%，91.63%。3次試驗的蘆薈大黃素平均值為90.04%，與理論值90.80%相差0.6%。因此，該模型能較好地反映蘆薈大黃素最佳合成工藝條件，從而證明了響應面分析設計方法在確定蘆薈大黃素最佳合成工藝條件的可行性。

4 結論

本研究采用響應曲面法分析了β-葡萄糖苷酶催化合成蘆薈大黃素的工藝。通過分析及試驗證明，當叔丁醇與水的體積比為3.5∶6.5，β-葡萄糖苷酶的體積酶活性為50 μ·mL-1，在43℃，100 r·min-1條件下反應 4 h，蘆薈大黃素的得率為90.04%。

［1］ 廖志華，談 鋒.蘆薈的藥理作用［J］.國外醫(yī)藥:植物藥分冊，1999，14(4):184-185.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業(yè)從出版社，2000:129.

［3］ VITTORI N，COLLINS M.Production of rhein and rhein derivatives:US，5652265［p］.1997

［4］ CARLINO，STEFANO，DI NAPOLI et al.Process for preparing aloe-emodin:US，7453004［p］.2005

［5］ S.卡里諾，G.迪納伯利.制備蘆薈大黃素的方法:CN，101104583A［p］.2007

［6］ 李建生，梁生旺，鄭曉珂，等.大黃素、蘆薈大黃素提取方法及其應用:CN，1887837［P］.2007