半月板碎片來源間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)及多向分化潛能

付維力 陳剛 李棋 唐新 李箭

四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科（成都610041）

半月板損傷后的治療一直是骨科及運(yùn)動醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐面臨的難題。 目前臨床針對半月板損傷的處理手段大體包括半月板切除、縫合修復(fù)、重建三個方面。 半月板部分或全部切除都將導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，繼而出現(xiàn)逐漸進(jìn)展的關(guān)節(jié)退變[1]。臨床上采用縫合修復(fù)的指征也相當(dāng)有限， 僅適用于一些單一縱裂的新鮮損傷類型[2]。盡管同種異體半月板移植被認(rèn)為是半月板缺損或切除后治療的金標(biāo)準(zhǔn)， 但長期的隨訪及組織學(xué)結(jié)果顯示僅有表淺部位少量的宿主細(xì)胞長入， 再者供體來源不足、組織處理及保存技術(shù)、半月板大小的匹配、手術(shù)固定技術(shù)以及半月板組織存活的細(xì)胞分子研究極大地限制其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[3]。

有研究發(fā)現(xiàn)半月板組織尤其是有血供區(qū)的損傷存在一定的自我修復(fù)能力[4]。 因此，我們提出假說半月板碎片組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells, MSC）樣細(xì)胞，這些細(xì)胞參與半月板損傷的病理生理和損傷后的修復(fù)過程。 本研究采用膠原酶消化的方法分離半月板碎片組織的單核細(xì)胞， 并探索其多向分化潛能， 為半月板種子細(xì)胞的篩選及再生提供參考。

1 材料與方法

1.1 半月板碎片的取材

本研究通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。半月板碎片取自3例在關(guān)節(jié)鏡下行半月板部分切除的確診為半月板損傷的患者， 年齡分別為25歲、32歲、47歲。 通過患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為半月板損傷。 在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出半月板碎片，置于含有雙抗的PBS中。

1.2 半月板碎片來源MSC樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在顯微鏡下切除帶血管的組織、 周圍附著的滑膜和韌帶，用含有雙抗的PBS漂洗3次。用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約1～5 mm3大小的組織碎塊， 然后在0.2%I型和II型混合膠原酶中振蕩消化4～6 h。 經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液等體積的含10%FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化， 用200目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，1200 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)后細(xì)胞按1×106/瓶（25 cm2培養(yǎng)瓶）重懸于完全培養(yǎng)基（低糖DMEM，10% FBS，3.7 g/L NaHCO3，100 U/ml青霉素，100μg/ ml鏈霉素，25 ng/ml兩性霉素B，2 mM L-谷氨酰胺）中，置于37℃含5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。 隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。 2～3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天換液1次。細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。 收集第3代細(xì)胞用于后面的實(shí)驗(yàn)。

1.3 半月板碎片來源MSC樣細(xì)胞的多向分化潛能

通過成骨、 成脂和成軟骨三系分化來評價半月板碎片來源MSC樣細(xì)胞的多向分化潛能。

成骨分化：取生長良好的第3代半月板碎片來源的MSC樣細(xì)胞，以3×103/cm2的密度接種于6孔板中，24 h后棄去培養(yǎng)基， 加入2 ml成骨誘導(dǎo)液 （高糖DMEM，10%FBS，0.1 μM地塞米松，10 mMβ-甘油磷酸鈉，50 μM抗壞血酸，2 mM L-谷氨酰胺，1%雙抗）。 每3天換液1次，誘導(dǎo)2周。 采用茜素紅染色和ALP染色評估成骨礦化和早期特異成骨基質(zhì)的分泌情況。

成脂分化：取生長良好的第3代半月板碎片來源的MSC樣細(xì)胞，以3×103/cm2的密度接種于6孔板中，24 h后棄去培養(yǎng)基， 加入2 ml成脂誘導(dǎo)液 （高糖DMEM，10%FBS，1 μM地塞米松，0.5 mMIBMX，10 g/ml胰島素，100 mM吲哚美辛，2 mM L-谷氨酰胺，1%雙抗），3天后換成成脂維持液 （高糖DMEM，10%FBS，10 g/ml胰島素，2 mM L-谷氨酰胺，1%雙抗），24 h后再換成成脂誘導(dǎo)液，如此循環(huán)，直到2周。采用油紅O染色評估細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成情況。

成軟骨分化： 采用三維細(xì)胞微團(tuán)和無血清培養(yǎng)體系評價半月板碎片來源的MSC樣細(xì)胞的成軟骨能力。收集1×106生長良好的第3代半月板碎片來源的MSC樣細(xì)胞， 在15 ml的聚丙烯錐形離心管中懸于1 ml成軟骨誘導(dǎo)液［100×ITS（6.25 μg/ml胰島素，6.25 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5.35 μg/ml亞麻酸， 6.25 ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μg/ml亞硒酸），1mmol/L丙酮酸鈉，0.17mmol/L抗壞血酸，0.1 μM 地 塞 米 松，0.35mmol/L 脯 氨 酸，10ng/ml TGFβ3］ 中，1500 rpm/min離心10 min， 置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，直到3周。 行HE、甲苯胺藍(lán)、II型膠原免疫組化染色評估微球大體及軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。

2 結(jié)果

2.1 半月板碎片來源MSC樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采用混合膠原酶消化的方法分離半月板碎片組織的單核細(xì)胞，2～3天后少量原代接種的細(xì)胞開始貼壁，由圓形伸展為梭形。原代接種4～6天后分離獲得的細(xì)胞呈典型的長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖1A）。 隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞迅速生長，顯微鏡下觀察呈一定方向性的漩渦狀生長。 10～14天后培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合（圖1B）， 用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。 直至第3代細(xì)胞形態(tài)較為均一（圖1C）。

2.2 半月板碎片來源MSC樣細(xì)胞的多向分化潛能

成骨分化： 分離的半月板碎片來源的細(xì)胞在體外成骨誘導(dǎo)條件下，3～7天后細(xì)胞生長緩慢、變得稀疏，細(xì)胞形態(tài)從長梭形變?yōu)槎噙呅?，可見結(jié)節(jié)出現(xiàn)。 1～2周結(jié)節(jié)逐漸變大，并分散均一。 通過ALP染色和茜素紅染色評估早期特異成骨基質(zhì)和礦化鈣結(jié)節(jié)的形成。 體外誘導(dǎo)14天后，ALP和茜素紅染色均為陽性（圖2），結(jié)果顯示分離的半月板碎片來源的細(xì)胞具備成骨分化潛能。

圖1 分離的半月板碎片來源細(xì)胞的形態(tài)特征（×100）

圖2 分離的半月板碎片來源細(xì)胞的體外成骨分化（×40）

成脂分化： 分離的半月板碎片來源的細(xì)胞在體外成脂誘導(dǎo)條件下，5～7天后細(xì)胞體積和細(xì)胞核逐漸增大，光鏡下可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)透亮的脂滴。 1～2周脂滴逐漸增大增多。 通過油紅O染色評估細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成情況。 體外誘導(dǎo)14天后，油紅O染色為陽性（圖3），結(jié)果顯示分離的半月板碎片來源的細(xì)胞具備成脂分化潛能。

圖3 分離的半月板碎片來源細(xì)胞的體外成脂分化（油紅O染色，×400）

成軟骨分化： 采用三維細(xì)胞微團(tuán)和無血清培養(yǎng)體系評價半月板碎片來源的MSC樣細(xì)胞的成軟骨能力。在體外成軟骨誘導(dǎo)條件下，3天后細(xì)胞團(tuán)塊逐漸變?yōu)榍蛐危?體外誘導(dǎo)21天后，HE染色顯示細(xì)胞呈圓形位于三維微團(tuán)里面，類似軟骨組織軟骨細(xì)胞位于陷窩內(nèi)。通過甲苯胺藍(lán)和II型膠原免疫組化染色分別顯示微團(tuán)軟骨特異性基質(zhì)蛋白多糖和II型膠原的表達(dá)， 染色均為陽性， 結(jié)果表明分離的半月板碎片來源的細(xì)胞具備成軟骨分化潛能（圖4）。

3 討論

本研究中我們采用混合膠原酶消化的方法分離獲得的半月板碎片來源的細(xì)胞呈典型的長梭形的MSC樣細(xì)胞形態(tài)，在體外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下具有分化成骨、成脂、成軟骨的潛能。有學(xué)者研究表明損傷的半月板組織中即使在無血供區(qū)域都存在一定的自發(fā)的愈合能力[5]，這也提示在細(xì)胞水平上， 半月板碎片組織可能存在一些干/祖細(xì)胞。 我們的研究證實(shí)了半月板碎片組織中存在MSC樣細(xì)胞， 這些細(xì)胞可能參與半月板損傷的病理生理和損傷后的修復(fù)過程。 半月板碎片組織中MSC樣細(xì)胞可能來源于周圍的滑液或滑膜， 半月板損傷后滑液中的MSC較正常組顯著增加[6]。 再者，半月板自身組織可能存在MSC，在損傷或其他病理?xiàng)l件下，這些細(xì)胞被激活募集到病變區(qū)域參與組織的修復(fù)重建過程[7]。另外，半月板鈣化也提示MSC存在于半月板組織中。 半月板組織中MSC的來源目前尚不清楚， 其確切的來源和去路還需要進(jìn)一步研究。

圖4 分離的半月板碎片來源細(xì)胞的體外成軟骨分化（×100）

以種子細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程及再生醫(yī)學(xué)策略為半月板的生物學(xué)再生帶來新的希望[8]。目前用于半月板再生的種子細(xì)胞主要分為分化成熟的半月板細(xì)胞和MSC[9]。 終末分化成熟的自體半月板細(xì)胞來源于損傷的半月板組織， 其來源于自體及確切的半月板細(xì)胞表型特征，一直被認(rèn)為是半月板再生最理想的種子細(xì)胞；但是其作為種子細(xì)胞也存在一些問題：需要兩次手術(shù)、病變組織來源的半月板細(xì)胞數(shù)量非常有限、 且缺乏增殖能力和正常半月板細(xì)胞的生物活性等[10]。 中胚層來源的成體MSC因其來源廣泛、優(yōu)良的自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、定向歸巢以及無倫理道德方面爭議等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于半月板再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11]。 在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)臈l件下，MSC能分化為中胚層、甚至內(nèi)外胚層的組織細(xì)胞。 但是，另一方面，MSC在體外培養(yǎng)擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)化、衰老或凋亡現(xiàn)象，常伴隨細(xì)胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點(diǎn)[12]。 再者，間充質(zhì)干細(xì)胞最傳統(tǒng)最經(jīng)典的來源是骨髓， 但其含量非常低（僅占有核細(xì)胞的0.01%～0.001%），且存在供區(qū)并發(fā)癥等缺點(diǎn)。 因此開發(fā)其他來源的MSC用于半月板的修復(fù)重建非常有意義。 盡管目前有很多其他組織如脂肪或滑膜組織等來源MSC用于半月板再生的種子細(xì)胞的報道， 但是這些組織來源MSC最大的缺點(diǎn)是其分化為半月板細(xì)胞的不確切性，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳[13]。 半月板碎片來源的組織特異MSC綜合半月板細(xì)胞的穩(wěn)定表型和MSC“干性”特征兩者的優(yōu)點(diǎn)，其分化確切，生物活性優(yōu)良， 是未來半月板再生及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中較為理想的一種種子細(xì)胞來源。 激活半月板碎片來源的組織特異MSC參與半月板損傷的修復(fù)重建及加速其向臨床的轉(zhuǎn)化也是開發(fā)半月板碎片原位MSC的意義所在。

本研究中我們采用混合膠原酶消化的方法分離獲得的半月板碎片來源的細(xì)胞貼壁生長， 呈典型的長梭形的MSC樣細(xì)胞形態(tài)， 在體外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下具有分化成骨、成脂、成軟骨的潛能。

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