張 巍， 金 瑛， 朱文赫， 李 妍， 羅 軍， 蘆曉靜， 陳默然， 姜艷霞

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

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肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶抑制劑胡桃醌對(duì)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞凋亡的作用*

張 巍△， 金 瑛， 朱文赫， 李 妍， 羅 軍， 蘆曉靜， 陳默然， 姜艷霞

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的： 探討肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶抑制劑胡桃醌對(duì)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其促凋亡的機(jī)制。方法: 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，將其分為空白對(duì)照組和不同劑量(10、20、50、80及100 μmol/L)胡桃醌給藥組，共6組。采用MTT法觀察胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞的抑制作用，并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50=20.4 μmol/L)，依據(jù)IC50確定胡桃醌的有效濃度；選取與IC50接近的濃度(20 μmol/L)通過(guò)Hoechst 33258及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、8、9以及抑癌基因PTEN的蛋白水平。結(jié)果: MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各給藥組對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Hoechst 33258檢測(cè)表明，20 μmol/L胡桃醌處理細(xì)胞12 h后可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核典型凋亡細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明胡桃醌可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡；Western blot檢測(cè)顯示與正常對(duì)照組相比，20 μmol/L胡桃醌處理細(xì)胞12 h后，cleaved caspase-3、8、9及PTEN的蛋白水平明顯增加。結(jié)論: 胡桃醌可以抑制SiHa細(xì)胞的活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制主要是通過(guò)抑制caspase途徑并增加抑癌基因的表達(dá)。

胡桃醌； 肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶； 細(xì)胞凋亡； SiHa細(xì)胞

肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(peptidyl-prolylcis/transisomerase，Pin1)是癌細(xì)胞中普遍存在的高表達(dá)的基因之一，其在腫瘤細(xì)胞中與細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，在正常組織中則低表達(dá)，去除它則腫瘤細(xì)胞增殖減低，凋亡增加。胡桃醌(juglone)是從胡桃揪新鮮根、枝皮及青果皮等中提取出來(lái)的羥基奈醌類(lèi)化合物，黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為155 ℃, 有升華性，微溶于熱水,是核桃楸中毒性物質(zhì)之一[1]。Hennig等[2]的研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可以抑制Pin1的活性，Pin1可特異性催化蛋白分子中磷酸化的Ser/Thr-Pro基序發(fā)生順?lè)串悩?gòu)轉(zhuǎn)變。近來(lái)的研究報(bào)道顯示，胡桃醌對(duì)多種癌細(xì)胞株具有活性作用，包括S180實(shí)體瘤、小鼠腹水型肝癌和自發(fā)性胃癌等[2-3]。Bhargava等[3]和Varga等[4]研究還發(fā)現(xiàn)：胡桃醌對(duì)人外周血的淋巴細(xì)胞鉀離子通道具有封閉作用，影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)和T細(xì)胞增殖；胡桃醌還可直接修飾巰基基團(tuán)，使RNA轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞mRNA的合成抑制，發(fā)揮阻斷轉(zhuǎn)錄的作用[4-5]。除此之外，胡桃醌還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要作用。另外的一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醌類(lèi)化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用表現(xiàn)在S期的抑制，而且這種細(xì)胞毒性作用于醌類(lèi)物質(zhì)的酚羥基個(gè)數(shù)相關(guān)[6]。而我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞(含HPV18 DNA)的增殖及促其發(fā)生凋亡的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究胡桃醌對(duì)另外一種宮頸鱗癌SiHa(含HPV16 DNA)的細(xì)胞凋亡的影響，從而為胡桃醌的抗宮頸癌作用提供重要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑和儀器

SiHa細(xì)胞系由本院科研實(shí)驗(yàn)室保存。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胡桃醌(5-羥基-1,4-奈醌)、Hoechst 33258和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 購(gòu)于Sigma。I 抗兔抗人cleaved caspase-3，8，9和PTEN單克隆抗體均購(gòu)自Abcam。Olympus 倒置顯微鏡(Olympus)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液并置于5% CO2、95%濕度及37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，2 d更換1次培養(yǎng)液，每周按1∶3傳代。

2.2 細(xì)胞活力的檢測(cè) 將培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞按1×108/L的密度接種于96孔板，分為空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組(10、20、50、80及100 μmol/L濃度的胡桃醌)共6組，再培養(yǎng)24 h 后,與空白對(duì)照組一起每孔加入20 μL MTT(5 g/L)， 37 ℃繼續(xù)孵育4 h。4 h后取出棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，測(cè)量前振板10 min，于570 nm測(cè)定A值。IC50通過(guò)計(jì)算軟件獲得。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取IC50附近濃度值20 μmol/L，采用Hoechst 33258染色法，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2 次，每次2 min; 加入多聚甲醛固定15 min，吸出固定液，用PBS 洗2 次，每次2～3 min; 每孔加入1 mL Hoechst 33258 工作液，避光染色5 min，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡，隨機(jī)觀察5個(gè)視野。

2.4 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板過(guò)夜，棄上清，加入20 μmol/L胡桃醌，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入Annexin V-FITC和PI，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Annexin V及PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按2.4方法處理細(xì)胞，加藥12 h 后提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，變性后上樣30 μg，于12% SDS-PAGE 分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜并用5%脫脂奶粉于37 ℃條件下封閉2 h，抗 cleaved caspase-3、8、9和PTEN的 I 抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h，曝光顯影。實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平與對(duì)照組相比為相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTT實(shí)驗(yàn)表明胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，隨胡桃醌濃度的增加抑制作用增強(qiáng)；各給藥組與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IC50為20.4 μmol/L，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of juglone on the cell viability. Mean±SD. n=4. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 μmol/L.

2 胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞核形態(tài)的影響

對(duì)照組SiHa細(xì)胞大小均一，成彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光；經(jīng)20 μmol/L胡桃醌處理12 h后，SiHa細(xì)胞核明顯皺縮，并可見(jiàn)致密強(qiáng)熒光，存在核碎裂和凋亡小體等強(qiáng)熒光團(tuán)塊，見(jiàn)圖2。

3 胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞早期凋亡的影響

如圖3所示，胡桃醌(20 μmol/L)與SiHa細(xì)胞作用12 h后，細(xì)胞早期凋亡率(右下象限)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。

4 Western blotting 法確定胡桃醌對(duì)SiHa細(xì)胞內(nèi)caspase-3、8、9和PTEN蛋白含量的影響

如圖4所示，Western blotting 法分析表明20 μmol/L胡桃醌組cleaved caspase-3、8、9和PTEN蛋白表達(dá)均升高。

Figure 2.The nuclear morphological changes of the SiHa cells treated with 20 μmol/L juglone(×400).

Figure 3.The effect of juglone (20 μmol/L) on the early apoptosis of SiHa cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 4.The protein levels of caspase-3, 8, 9 and PTEN in the SiHa cells treated with juglone at concentration of 20 μmol/L for 12 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

討 論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是它的主要致病原因, 在對(duì)宮頸癌高危人群的篩查及治療效果評(píng)價(jià)時(shí)，HPV是主要生物學(xué)指標(biāo)[8-10]。在對(duì)HPV的治療上，目前尚無(wú)理想藥物，在高危HPV16、18等感染問(wèn)題上，尤其缺乏針對(duì)性的特效方法。我國(guó)物產(chǎn)豐富，植物藥用資源很多, 在中草藥研究中，發(fā)現(xiàn)了一批療效好、不良反應(yīng)小的天然抗癌、抗病毒藥物，這為病毒感染所致癌癥的防治工作帶來(lái)了新的希望[11]。

胡桃醌又名5-羥基-1，4-萘醌，是一種從胡桃楸的葉、皮及外果殼中提取天然環(huán)狀醌類(lèi)，早有抗腫瘤作用的報(bào)道。Pin1在各類(lèi)癌細(xì)胞中普遍高表達(dá)，與癌細(xì)胞的分化與增殖有關(guān)，在正常組織中表達(dá)卻很低，敲除Pin1則腫瘤細(xì)胞增殖減低，細(xì)胞凋亡增加[12]。胡桃醌抗腫瘤活性的機(jī)制是胡桃醌與Pin1催化域不可逆性結(jié)合，抑制Pin1的活性，抑制了細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)以HPV16陽(yáng)性的人宮頸鱗癌細(xì)胞株SiHa為研究對(duì)象, 研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的胡桃醌可明顯抑制SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)，其IC50為20.4 μmol/L。

細(xì)胞凋亡是指基因控制細(xì)胞自主的有序的死亡，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，這與細(xì)胞壞死過(guò)程明顯不同，細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，涉及一系列基因的激活與表達(dá)，在受控中發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用；而細(xì)胞壞死是病理?xiàng)l件下自體損傷現(xiàn)象，是一個(gè)被動(dòng)的過(guò)程，細(xì)胞凋亡是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境，主動(dòng)的一種死亡過(guò)程[15]。Caspase是一個(gè)在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，caspase-3可以剪切caspase-2、6、7、9的前體，這種蛋白酶剪切是細(xì)胞凋亡的重要組成部分。Caspase-8通常以酶原形式存在，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中被激活，其被認(rèn)為是caspase凋亡通路上游的酶，被激活后可激活下游的caspase-4、6、9和10。Caspase-9也屬于上游酶，被激活后可活化最關(guān)鍵的酶caspase-3，從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。本研究結(jié)果通過(guò)細(xì)胞核染色檢測(cè)觀察，發(fā)現(xiàn)胡桃醌可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制研究也發(fā)現(xiàn)，胡桃醌可導(dǎo)致cleaved caspase-3、8、9表達(dá)升高。PTEN為一種抑癌基因，通過(guò)化學(xué)通路傳導(dǎo)，把信號(hào)傳給細(xì)胞，使細(xì)胞停止分裂并進(jìn)入程序性死亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可促進(jìn)SiHa細(xì)胞的PETN蛋白表達(dá)。說(shuō)明胡桃醌的促凋亡機(jī)制可能是通過(guò)激活caspase途徑以及提高抑癌基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究旨在為宮頸癌的治療提供一個(gè)新的思路，其具體的作用機(jī)制及藥物作用的靶點(diǎn)等仍待進(jìn)一步深入細(xì)致的研究。

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Pin1 inhibitor juglone induces apoptosis in human cervical cancer SiHa cells

ZHANG Wei, JIN Ying, ZHU Wen-he, LI Yan, LUO Jun, LU Xiao-jing, CHEN Mo-ran, JIANG Yan-xia

(JilinMedicalCollege,Jilin132013,China.E-mail:jlmmczw@163.com)

AIM: To explore the effect of peptidyl-prolylcis/transisomerase (Pin1) inhibitor juglone on apoptosis of human cervical cancer SiHa cells. METHODS: Cultured SiHa cells were incubated with juglone at concentrations of 10, 20, 50, 80 and 100 μmol/L for 24 h. The SiHa cell activity was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Hoechst 33258 staining. The protein levels of cleaved caspase-3,8,9 and PTEN was determined by Western blotting. RESULTS: In different doses of juglone groups, the SiHa cell growth was greatly inhibited (P<0.05) in a dose-dependent manner as compared with control group. The IC50of juglone was 20.4 μmol/L. After treatment with juglone at concentration of 20 μmol/L for 12 h, the apoptosis of SiHa cells was induced, and the typical morphological changes of cell apoptosis such as karyopyknotic pyknic hyperfluorescence bolus, nuclear fragmentation and apoptotic body were observed by Hoechst 33258 staining. The early apoptotic rate was increased significantly as compared with the control. The protein levels of cleaved caspase-3, 8, 9 and PTEN were also increased significantly as compared with control group. CONCLUSION: Juglone significantly inhibits the cell activity and induces the apoptosis of SiHa cellsinvitroby inhibiting the caspase pathway and increasing the expression of anti-oncogene.

Juglone; Peptidyl-prolylcis/transisomerase; Apoptosis; SiHa cells

1000- 4718(2015)03- 0543- 04

2014- 09- 23

2014- 12- 29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 21102055)；吉林省科技廳科技發(fā)展項(xiàng)目(No. 20130101157JC)；吉林省教育廳“十二五”教育技術(shù)研究項(xiàng)目(No. 2012-314；2014-371)

△ 通訊作者 Tel: 0432-64560459; E-mail： jlmmczw@163.com

R363;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.028