吳 潔， 張偉金， 黃巧冰

(南方醫(yī)科大學 1第一臨床醫(yī)學院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣東 廣州 510515)

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·綜 述·

肌球蛋白輕鏈激酶介導(dǎo)內(nèi)皮細胞屏障功能變化的研究進展*

吳 潔1， 張偉金1， 黃巧冰2△

(南方醫(yī)科大學1第一臨床醫(yī)學院，2基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣東 廣州 510515)

血管內(nèi)皮細胞是連續(xù)被覆于全身血管內(nèi)膜的一層細胞群，不僅構(gòu)成一道半選擇通透性屏障，還合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，維持正常的心血管功能。血管內(nèi)皮細胞的完整和屏障功能完好對于維持心血管穩(wěn)態(tài)有至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細胞受損所致屏障功能下降是血管病變的始動環(huán)節(jié)，如腦血管內(nèi)皮連接受損導(dǎo)致的腦水腫[1]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是第1個被發(fā)現(xiàn)的依賴于鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)的絲/蘇氨酸特異性蛋白激酶，隨著對其結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，MLCK在介導(dǎo)內(nèi)皮細胞通透性改變中所起的重要作用引起了廣泛關(guān)注，本文就此做一綜述。

1 MLCK的生化特性

1.1 MLCK家族 MLCK是免疫球蛋白超家族的一員，屬于Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶家族，由位于人類3、20、16號染色體上的mylk1～3基因編碼[2]。心肌型MLCK(cardiac myosin light chain kinase，cMLCK)和骨骼肌型MLCK(skeletal myosin light chain kinase，skMLCK)分別由mylk3和mylk2編碼，而平滑肌型MLCK(smooth muscle myosin light chain kinase，smMLCK)和非肌型MLCK(non muscle myosin light chain kinase，nmMLCK)則由mylk1編碼[3]。cMLCK 和skMLCK的表達分別僅限于心肌和骨骼肌組織。與此相反，smMLCK普遍存在于成熟組織，以平滑肌組織含量最多。而nmMLCK又分為MLCK1～4個亞型，其中內(nèi)皮細胞主要表達MLCK1和MLCK2。

1.2 MLCK的結(jié)構(gòu)及功能 MLCK家族分子結(jié)構(gòu)存在較大差異，但smMLCK與nmMLCK較為相似。smMLCK由1 147個氨基酸組成，分子量約為108 kD，因此又被稱作MLCK108。smMLCK的N端含有1個包含纖連蛋白的結(jié)構(gòu)域、2個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和多個磷酸化位點。nmMLCK與smMLCK的不同之處在于其N端所特有的922個氨基酸殘基序列，包含 6 個延伸的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及2個串聯(lián)的肌動蛋白結(jié)合區(qū)。nmMLCK分子量約為210 kD，4個亞型的不同在于其組成的1 914個氨基酸序列的不同。

MLCK的主要功能是對肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)進行磷酸化，其活性直接影響肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用并引起細胞中心張力的改變，因此MLCK在肌肉收縮和細胞遷移等方面發(fā)揮重要作用。在平滑肌細胞，Ca2+與CaM的結(jié)合激活smMLCK，使得肌球蛋白頭部輕鏈磷酸化，Mg2+-ATP酶被激活并分解ATP產(chǎn)生能量，促進橫橋擺動，進而拖動細肌絲滑行，從而完成一次平滑肌收縮。然而，在內(nèi)皮細胞和其它非肌細胞，Ca2+與CaM的結(jié)合還不足以激活MLCK，仍需要其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與[4]。

2 MLCK介導(dǎo)內(nèi)皮細胞通透性改變的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

血管內(nèi)皮正常屏障功能的維持有賴于緊密連接(tight junction，TJ)、黏附連接(adherence junction，AJ)和細胞骨架收縮之間的動態(tài)平衡。細胞間連接提供黏附力，細胞骨架收縮形成向心力，兩種力達到平衡才能維持正常的屏障功能。細胞收縮是各種原因引起屏障通透性增加的共同途徑，主要受肌動蛋白和肌球蛋白的影響，二者相互作用使細胞產(chǎn)生收縮力，當收縮力大于黏附力時，內(nèi)皮通透性增高。

作為馬達蛋白的肌球蛋白II由2條200 kD的重鏈和4條20 kD的輕鏈組成，重鏈形成2條平行的鏈型結(jié)構(gòu)，其氨基末端頭部與ATP和肌動蛋白作用介導(dǎo)肌絲滑行。輕鏈分為2條基礎(chǔ)性輕鏈和2條調(diào)節(jié)性輕鏈(regulatory light chain，RLC)，前者起穩(wěn)定重鏈結(jié)構(gòu)的作用，后者調(diào)節(jié)肌球蛋白的活性，而MLCK激活的正是RLC[5]。肌球蛋白的主要作用是調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)并參與細胞的多種生理活動，而這些主要通過MLC的磷酸化與去磷酸化實現(xiàn)[6]。MLC 的磷酸化是生物屏障通透性增加的分子基礎(chǔ)[7]，磷酸化型 MLC 通過活化肌球蛋白重鏈頭部的 ATP 酶，產(chǎn)生能量介導(dǎo)骨架蛋白微絲滑動，促使細胞收縮和細胞間連接改變，最終細胞間隙形成，通透性增加。研究表明，許多細胞因子、炎癥介質(zhì)等神經(jīng)及體液介質(zhì)均可通過 MLC 磷酸化而引起屏障通透性增加[8-9]。在MLCK介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性增高中，效應(yīng)分子MLC的磷酸化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而MLCK的激活依賴于輔助因子Ca2+與CaM的結(jié)合、上游激活蛋白Src和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的作用、一氧化氮(nitric oxide, NO)與環(huán)鳥苷酸(cyclin guanosine monophosphate,cGMP)信號分子以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路的參與。

2.1 MLCK介導(dǎo)MLC磷酸化 MLCK介導(dǎo)內(nèi)皮細胞通透性增加依賴于MLC的磷酸化，MLCK 通過磷酸化MLC的第18位絲氨酸和第19位蘇氨酸激活肌球蛋白重鏈頭部ATP酶，產(chǎn)生的能量引起內(nèi)皮細胞肌動蛋白與肌球蛋白II相互作用，使得細胞收縮，細胞間隙形成，通透性增加[10]。MLC 磷酸化除了主要受 MLCK 調(diào)控外，還受到肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的負調(diào)控[11]。MLCP 催化MLC 從磷酸化型向非磷酸化型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致磷酸化型 MLC 減少，而 MLCP 活性則又受到Rho激酶(ROCK)的負調(diào)控。因此，ROCK的激活是 MLC 發(fā)生磷酸化的又一原因。

2.2 Ca2+通道 Ca2+在血管內(nèi)皮的功能運行中扮演著十分重要的角色，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化調(diào)節(jié)著細胞的代謝、基因表達等活動。通過與CaM結(jié)合，Ca2+是調(diào)節(jié)MLCK活性最基本的介質(zhì)。Ca2+通道的激活對于細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控至關(guān)重要，因此在MLCK誘導(dǎo)內(nèi)皮通透性增高的過程中，Ca2+通道的作用十分重要。研究指出[12]，瞬時受體電位Ca2+通道(transient receptor potential channels，TRPC)的激活能夠誘導(dǎo)腦毛細血管內(nèi)皮通透性增高，而MLCK抑制劑ML-9能夠阻止TRPC的活化以及內(nèi)皮通透性增高，這就說明MLCK通過TRPC的活化導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增高。MLCK介導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性也可能和鈣池操縱的鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOC)的活化有密切關(guān)系。研究表明[13]，SOC通道的活化依賴于三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptor，IP3R)活化所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放，IP3R的活化引發(fā)MLC磷酸化以及MLC磷酸化依賴的緊密連接蛋白occludin和claudin-5的磷酸化，而后二者的磷酸化是MLCK依賴性的，這提示在內(nèi)皮通透性增高中，MLCK處于SOC通道的上游。然而相反的觀點仍然存在，有報道指出TRPC抑制劑SKF96365能夠阻止缺氧造成的鼠腦內(nèi)皮細胞MLC磷酸化和通透性增高[14]。

2.3 Src Src蛋白激酶參與了內(nèi)皮細胞TJ和AJ構(gòu)成的蛋白形態(tài)的改變，細胞黏附力降低及應(yīng)力纖維形成增多，進而導(dǎo)致細胞間收縮力增加和間隙增大，最終血管通透性升高[15]。酪氨酸激酶Src通過磷酸化MLCK的Y464和Y471位點從而激活MLCK，因MLCK2沒有包含這2個位點的剪接變體，所以其活化作用僅限于MLCK1[16]。另有證據(jù)表明[17]，通過基因沉默、位點突變和藥物抑制等方法抑制Src的表達，都能夠顯著減緩MLCK依賴的內(nèi)皮屏障功能紊亂。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生能夠直接或間接地作用于內(nèi)皮細胞，使得受損的血管松弛、白細胞黏附增加和內(nèi)皮通透性升高[18]。p47phox是NADPH氧化酶系統(tǒng)的主要成份，Src能夠介導(dǎo)p47phox和皮層肌動蛋白(cortactin)的酪氨酸位點磷酸化，促進ROS的產(chǎn)生。在肺內(nèi)皮細胞中，組織內(nèi)氧過多會以Src依賴的方式激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生ROS或超氧化物[19]。最新的研究證明，肺動脈內(nèi)皮細胞中過表達的野生型MLCK會增強p47phox與cortactin在細胞外圍的共定位和ROS的產(chǎn)生，且使用MLCK siRNA下調(diào)MLCK的表達顯著抑制上述現(xiàn)象[20]。這個研究提示，MLCK除了可以介導(dǎo)MLC的磷酸化導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的收縮和通透性的增加，還可通過與cortactin的相互作用，為Src與NADPH等結(jié)合形成復(fù)合物并介導(dǎo)ROS的生成提供反應(yīng)平臺，進一步加重內(nèi)皮細胞的損傷。

2.4 PKC PKC是一類分子量在78～90 kD的同工酶家系，是最早被確認的蛋白激酶之一。PKC被激活后移位到細胞膜對其底物進行酸化作用，其經(jīng)典亞型PKCα和PKCβ誘導(dǎo)內(nèi)皮高通透性的作用廣為人知。PKC信號通路涉及細胞骨架重組和細胞收縮、Ca2+通道等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PKC與MLCK二者的活化對于炎癥細胞因子誘導(dǎo)的高通透性缺一不可[21]。

Guntaka等[22]發(fā)現(xiàn)，在膽管上皮細胞，MLCK抑制劑ML-7能夠顯著減緩PKC誘導(dǎo)的屏障功能紊亂。另有研究表明[23]，ML-7能夠緩解離體冠狀靜脈PKC激活而介導(dǎo)的通透性過高。這些提示PKC介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞通透性增高很有可能與MLCK的活化有關(guān)。研究證實，PKC活化與胞內(nèi)Ca2+增多協(xié)同作用能導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的MLC磷酸化增多和通透性增高。PKCα與MLCK被認為是調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)損傷最關(guān)鍵的蛋白質(zhì)，PKCα被激活后，引起下游骨架蛋白磷酸化，最終激活MLCK，使MLC發(fā)生磷酸化，介導(dǎo)肌球-肌動蛋白間相互作用，從而引起內(nèi)皮細胞的收縮，最終導(dǎo)致細胞旁間隙形成、血管通透性增加[24]。因此認為，PKC處于MLCK上游，通過磷酸化MLCK介導(dǎo)內(nèi)皮細胞通透性增高。

2.5 NO與cGMP NO在多條信號通路中發(fā)揮作用，不僅可與ROS結(jié)合生成ONOO-，還能夠亞硝基化很多蛋白質(zhì)。在導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增高的信號通路中，NO能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)，使得GC催化GTP轉(zhuǎn)變?yōu)閏GMP。 在不同類型的細胞中，cGMP通過不同的調(diào)節(jié)機制增加或者降低內(nèi)皮通透性。而在MLCK依賴的內(nèi)皮細胞通透性增高中，NO與 cGMP處于PKC的下游?；罨腜KCα能夠磷酸化內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的S1179位點從而將其激活，促使NO生成增多，并進一步導(dǎo)致cGMP生成增加。cGMP激活蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)后，通過其下游MAPK通路激活MLCK，引起MLC磷酸化和通透性增高。除此之外，cAMP也參與了cGMP對內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)節(jié)。研究顯示[25]，患有肺損傷的鼠肺內(nèi)皮中cGMP的產(chǎn)生增加會導(dǎo)致cAMP的水解增多，而HUVECs中cAMP的增加或減少也受cGMP濃度的影響[26]。在大多數(shù)內(nèi)皮細胞中，cAMP依賴的蛋白激酶PKA能抑制MLCK活性及內(nèi)皮高通透性。因此，在一些內(nèi)皮系統(tǒng)，cGMP和PKG依賴的MLCK活化也可能通過減少cAMP和降低蛋白激酶(protein kinase A, PKA)A的活性而實現(xiàn)。

2.6 MAPK通路 MAPK屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，在多種受體信號傳遞途徑中具有關(guān)鍵作用。細胞間信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是參與細胞形態(tài)維持及細胞骨架構(gòu)建最主要的MAPK 家族成員之一。研究表明，ERK能夠增強內(nèi)皮細胞MLCK活性和MLC磷酸化，導(dǎo)致細胞間連接破壞和間隙形成[27]。在人動脈內(nèi)皮細胞(human aortic endothelial cells，HAECs)，MLCK所介導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成也是 ERK依賴性的[28]。另有證據(jù)表明[29]，在HUVECs中MLCK活性受ERK-MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，而Woody等[30]發(fā)現(xiàn)ERK2的抑制劑能有效抑制MLCK磷酸化。因此認為，ERK在MLCK誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性增高中起到重要作用。

外傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)所造成的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能損傷中，MLCK導(dǎo)致的細胞骨架重組起到關(guān)鍵作用。研究顯示[31]，TBI發(fā)生后白蛋白能夠通過p38MAPK通路激活MLCK，最終導(dǎo)致BBB功能紊亂。由此可見，MAPK通路在MLCK調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性改變中占據(jù)重要地位。

綜上所述，多種信號分子能夠通過不同的通路激活MLCK，從而導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能紊亂。如圖1所示，MLCK介導(dǎo)內(nèi)皮通透性增高的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于MLCK介導(dǎo)的MLC磷酸化。MLC同時受MLCP的負調(diào)控，ROCK則對MLCP有抑制作用。Ca2+與CaM的結(jié)合直接激活MLCK。Src通過磷酸化Y464和Y471位點從而激活MLCK。PKC不僅能夠直接激活MLCK，還可以磷酸化eNOS的S1179位點從而將其激活，并導(dǎo)致NO、cGMP等信號分子增多，通過下游MAPK通路激活MLCK。另外，cGMP對環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的負調(diào)控及PKA對MLCK的負調(diào)控最終促進MLCK的激活，p38MAPK通路同樣可以激活MLCK。

Figure 1.Main signaling pathways of MLCK-mediated endothelial barrier dysfunction.

3 展望

由此可見，MLCK通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，提高肌球蛋白活性，使肌動-肌球蛋白交聯(lián)增加，導(dǎo)致細胞收縮和細胞間隙擴大，最終血管內(nèi)皮通透性增加。而在內(nèi)皮屏障功能紊亂和通透性增加中，MLCK介導(dǎo)的MLC磷酸化是細胞內(nèi)眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)。目前已有臨床研究發(fā)現(xiàn)[32]，MLCK可以作為急性肺損傷等疾病的相關(guān)藥物作用靶點，MLCK210基因敲除或者MLCK抑制劑的使用都能夠達到保護肺功能的效果。因此，MLCK將會為更多相關(guān)疾病的治療提供可能的作用靶點，從而為患者提供更好的幫助。

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Effects of myosin light chain kinase on regulation of endothelial barrier function

WU Jie1, ZHANG Wei-jin1, HUANG Qiao-bing2

(1FirstClinicalCollegeofMedicine,2SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:bing@smu.edu.cn)

Myosin light chain kinase (MLCK) activates the regulatory light chain of myosin II, and the phosphorylated myosin light chain leads to actomyosin contractile activity, as well as the cell contraction and increasing intercellular gap, which finally results in endothelial barrier dysfunction. MLCK-dependent hyperpermeability occurs in response to multiple cell signaling molecules and signaling pathways, including Ca2+, Src, PKC, NO, cGMP and mitogen activated protein kinases (MAPK). In this review, different mechanisms of endothelial hyperpermeability mediated by MLCK are discussed.

肌球蛋白輕鏈激酶； 肌球蛋白； 內(nèi)皮細胞； 通透性

Myosin light chain kinase; Myosin; Endothelial cells; Permeability

1000- 4718(2015)03- 0572- 05

2014- 10- 22

2014- 12- 03

國家自然科學基金資助項目(No. 81370226)；廣東省自然科學基金團隊項目(No. S2013030013217)

△通訊作者 Tel： 020-61648465; E-mail: bing@smu.edu.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.034