鄧健錕， 王淑君, 吳洪鑾， 羅勉娜, 許碧華， 梁 東， 潘慶軍， 劉華鋒， 劉偉敬

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，廣東 湛江 524001)

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尿蛋白及晚期糖基化終產(chǎn)物對腎小管上皮細胞溶酶體的影響*

鄧健錕▲， 王淑君▲, 吳洪鑾， 羅勉娜, 許碧華， 梁 東， 潘慶軍， 劉華鋒， 劉偉敬△

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，廣東 湛江 524001)

目的： 探討慢性腎臟病(CKD)病程中所產(chǎn)生的病理產(chǎn)物尿蛋白及晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)對腎小管上皮細胞(tubular epithelial cells，TECs)溶酶體結(jié)構(gòu)與功能的影響，為阻止或延緩CKD病情進展探索新思路。方法: 臨床上選取未經(jīng)特殊治療的微小病變腎病綜合征(MCNS)患者(n=11)、糖尿病腎病(DN)患者(n=11)及活檢基本正常(n=6)的腎組織標本，以溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1)和組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)行間接免疫熒光染色；體外以8 g/LJ尿蛋白或100 mg/L晚期糖基化終產(chǎn)物刺激人腎小管上皮細胞系(HK-2細胞)，以LAMP1和CB行間接免疫熒光染色，檢測 CB及組織蛋白酶L (cathepsin L，CL)活性，并觀察DQ-卵清蛋白降解情況。結(jié)果: MCNS及DN患者TECs存在溶酶體膜透化(lysosomal membrane permeabilization，LMP)現(xiàn)象。與正常對照組相比，尿蛋白及AGE-BSA均可致HK-2細胞LMP發(fā)生率上升,CB及 CL活性降低,溶酶體對DQ-卵清蛋白的降解能力降低(P<0.05)。結(jié)論: CKD病理產(chǎn)物尿蛋白和晚期糖基化終產(chǎn)物均可致TECs出現(xiàn)LMP現(xiàn)象，并使溶酶體消化功能下降，這可能是CKD腎小管間質(zhì)纖維化進展的重要機制之一。

腎小管上皮細胞； 溶酶體； 尿蛋白； 晚期糖基化終產(chǎn)物

現(xiàn)已基本明確，腎小球疾病患者腎小管-間質(zhì)的損害程度與腎功能毀損程度高度正相關(guān)，其危害甚于腎小球損傷[1]。對于腎小球疾病患者，除了原發(fā)性腎小球損傷，繼發(fā)性腎小管上皮細胞(tubular epithelial cells，TECs)損傷處于腎小管-間質(zhì)纖維化整個病理生理過程的上游環(huán)節(jié)，對整個慢性腎衰竭病程的進展具有“承上啟下”的作用[2]。因此，控制TECs損傷是阻止或延緩腎小管-間質(zhì)纖維化進展的關(guān)鍵策略之一，而且對控制慢性腎衰竭整個病程的進展也有極其重要的意義。引起TECs損傷的原因甚多，對于我國慢性腎衰竭最主要病因的原發(fā)性腎小球疾病而言，尿蛋白作為腎小球損害的病理產(chǎn)物，是繼發(fā)性腎小管損害的首要原因[3]。隨著社會發(fā)展和人們生活方式改變，近年來糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)也已成為慢性腎衰竭又一主要病因，其病理產(chǎn)物糖基化終產(chǎn)物也是繼發(fā)性腎小管損害的重要因素[4]。因此，尿蛋白和糖基化終產(chǎn)物是當(dāng)前主要慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病過程中的主要病理產(chǎn)物。

溶酶體為膜封閉細胞器，存在于胞質(zhì)，含各種水解酶以完成對細胞成分和大分子的降解[5]，細胞內(nèi)許多降解途徑如異噬、自噬等[6]都是通過溶酶體來執(zhí)行。有研究報道溶酶體可降解重吸收的尿蛋白[7-8]，溶酶體組織蛋白酶促進晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGE)相關(guān)修飾蛋白的降解，減輕其細胞毒性[9-10]，由此可見溶酶體-蛋白降解系統(tǒng)在一定程度上對TECs維持細胞穩(wěn)態(tài)，對抗損傷因素，促進細胞存活具有重要意義。然而，CKD病程中產(chǎn)生的尿蛋白和糖基化終產(chǎn)物等病理產(chǎn)生對TECs溶酶體影響如何，目前未見研究報道。

材 料 和 方 法

1 材料

人腎小管上皮細胞系HK-2細胞(ATCC細胞庫)；胎牛血清及DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(Gibco)；AGE(Biovision)；兔抗人溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosmal-associated membrane protein 1 ,LAMP1)及鼠抗人組織蛋白酶B(cathepsin B, CB) I抗(Abcam)；驢抗兔Alexa Fluor? 488及羊抗鼠Alexa Fluor? 594 II抗、DQ-卵清蛋白(Invitrogen)；CB及組織蛋白酶L(cathepsin L, CL)試劑盒(Biovision)；激光共聚焦顯微鏡(Leica)。

2 實驗方法

2.1 腎組織標本采集 微小病變腎病綜合征(minimal change nephrotic syndrome，MCNS)腎組織標本(n=11)來源于未經(jīng)治療且病程小于1個月、腎臟病理明確診斷為MCNS的患者；DN腎組織標本(n=11)來源于腎臟病理明確診斷為DN的患者；對照腎組織標本(n=6)來源于臨床上以血尿為主要表現(xiàn)而腎組織活檢為基本正常的患者。

2.2 尿蛋白提取 進入本研究的MCNS患者均經(jīng)病理學(xué)確診，無感染及并發(fā)癥，且未使用腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療，無可疑腎毒藥物(包括中藥)應(yīng)用史。收集MCNS患者的尿液，之后以硫酸銨沉淀法提取尿蛋白[11]。

2.3 細胞的培養(yǎng)及刺激 HK-2細胞以含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的條件下進行培養(yǎng)傳代用于實驗。經(jīng)預(yù)實驗調(diào)整藥物刺激濃度和時間，確定以8 g/L尿蛋白刺激細胞16 h或100 mg/L AGE刺激細胞6 h。

2.4 免疫熒光法檢測腎組織及 HK-2細胞LAMP1和CB的表達[12-13]收集病人腎組織標本制成冰凍切片，另胰酶消化細胞后制成細胞懸液，按2×108/L的密度將細胞接種于內(nèi)含蓋玻片的12孔板，待貼壁完全加入上述刺激物，刺激完畢收集各組HK-2細胞爬片。4%多聚甲醛固定，0.25% PBS-Triton X-100中通透，5% BSA封閉抗原后，滴加用2.5% BSA稀釋的兔抗人LAMP1的 I抗(1∶200)和鼠抗人CB的I抗(1∶600)， 4 ℃孵育過夜。次日PBS浸洗后，滴加驢抗兔Alexa Flour? 488的 II抗(1∶300)和羊抗鼠594 的II抗(1∶300)37 ℃孵育60 min，避光操作，PBS浸洗后滴加DAPI染核5 min后再次浸洗，封片后通過激光共聚焦顯微鏡檢測。每次實驗至少統(tǒng)計200個HK-2細胞，計算CB彌散細胞數(shù)量占總細胞數(shù)量百分比。

2.5 生物化學(xué)法檢測酶的活性 以CB和CL試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中的CB和CL的水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書。

2.6 溶酶體降解能力檢測 細胞經(jīng)尿蛋白及AGE刺激后，在加有10 mg/L DQ-卵清蛋白的培養(yǎng)液中共培養(yǎng)2 h，經(jīng)PBS洗滌及4%多聚甲醛固定，之后以激光共聚焦顯微鏡檢測。每次實驗至少統(tǒng)計30個細胞，統(tǒng)計每一個HK-2胞漿的DQ點數(shù)量(綠色熒光點)，計算實驗組與對照組倍數(shù)比。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差(mean±SD)表示。兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗；多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)的比較首先用方差齊性檢驗，當(dāng)總體方差齊時，選擇Bonferroni法；當(dāng)方差不齊時，選擇Tamhane’s T2法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 尿蛋白及AGE致溶酶體膜透化發(fā)生

對照腎組織腎小管上皮細胞CB和LAMP1呈點狀分布，且多數(shù)共定位存在；而MCNS患者腎組織及糖尿病腎病患者腎組織多數(shù)TECs 內(nèi)CB彌散至整個胞漿，LAMP1排列不規(guī)則，見圖1。體外實驗采用HK-2細胞進一步證實了以上結(jié)果。統(tǒng)計胞漿彌散分布CB熒光的細胞數(shù)目占細胞總數(shù)的百分比，與對照組相比，尿蛋白組及AGE-BSA組該比例上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The distribution of CB and LAMP1 in TECs during the development of MCNS or DN. The scale bar=10 μm.

2 尿蛋白及AGE致溶酶體酶活性下降

如圖3所示，尿蛋白及AGE刺激后的HK-2細胞溶酶體酶CB和CL活性均下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 尿蛋白及AGE致溶酶體對DQ-卵清蛋白降解能力下降

我們通過檢測DQ-卵清蛋白熒光進一步明確溶酶體消化功能。如圖4所示，與對照組相比，尿蛋白及AGE刺激后HK-2細胞DQ-卵清蛋白(綠色熒光)點數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Figure 2.The distribution of CB and LAMP1 in the HK-2 cells after exposure to urinary proteins (UP， 8 g/L) for 16 h or AGE-BSA (100 mg/L) for 6 h . The scale bar=10 μm. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control； ##P<0.01 vs control BSA.

討 論

在本研究中，我們通過對某些酶和溶酶體膜進行間接免疫熒光雙標記的方法，首次直接證實了CKD病程中所產(chǎn)生的病理產(chǎn)物尿蛋白和AGE可致溶酶體膜通透化(lysosomal membrane permeabilization，LMP)。LMP發(fā)生后，溶酶體內(nèi)容物會透過溶酶體膜釋放到細胞漿，這些釋放至胞漿的溶酶體水解酶可非特異性消化細胞器；其次LMP作為細胞死亡信號傳導(dǎo)重要組成部分已達成廣泛共識，一旦溶酶體膜受損，泄露入胞漿的溶酶體酶可引起TECs發(fā)生細胞凋亡或自噬性死亡，而大量溶酶體破裂則可引起細胞壞死[12, 14-15]。溶酶體最重要的功能便是消化功能，溶酶體內(nèi)各種組織蛋白酶是其發(fā)揮消化功能的主體[16]。既然溶酶體有LMP發(fā)生，其消化功能可能受到影響。我們首先對溶酶體內(nèi)幾種主要的蛋白水解酶的活性進行了分析，發(fā)現(xiàn)尿蛋白和AGE-BSA均可致小管上皮細胞溶酶體CB和CL活性均降低。我們進一步通過檢測溶酶體對DQ-卵清蛋白的降解能力來說明其消化功能的變化。DQ-卵清蛋白是一種連接自我淬滅染料的卵清蛋白，此蛋白未被處理時不發(fā)出熒光，而當(dāng)它被細胞攝入消化后會呈現(xiàn)強烈的綠色熒光。如結(jié)果所示，尿蛋白和AGE-BSA刺激下培養(yǎng)腎小管上皮細胞DQ-卵清蛋白熒光明顯減少，即細胞降解DQ-卵清蛋白的能力下降，由此我們推斷上述2種病理產(chǎn)物刺激下溶酶體消化功能是下降的。溶酶體作為溶酶體-蛋白降解系統(tǒng)的重要組成部分，其消化功能降低可能導(dǎo)致異噬-溶酶體途徑和自噬-溶酶體途徑的阻塞。當(dāng)異噬-溶酶體途徑堵塞時，貯存胞內(nèi)降解受阻的尿蛋白可通過Bad[17]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[18]、氧化應(yīng)激[19-20]等多種途徑引起細胞凋亡。而此時自噬-溶酶體途徑的堵塞使得自噬無法發(fā)揮對抗尿蛋白所致TECs損傷的作用[21]。大量蛋白尿可通過削弱溶酶體消化功能導(dǎo)致TECs處理外來蛋白及降解自身受損蛋白的能力下降，進一步加重細胞損傷。早在2001年，有研究提示糖尿病致病因素可致腎臟溶酶體消化功能下降，其具體機制未明確，而溶酶體對白蛋白降解能力減弱與白蛋白尿的形成有著切密關(guān)系[22-23]。近幾年，亦有報道溶酶體消化功能下降伴隨著自噬流下降與DN發(fā)病機理相關(guān)[24]。另Shechter等[25]證明糖尿病條件下溶酶體損傷可致腎臟內(nèi)多種蛋白降解受阻，導(dǎo)致基質(zhì)堆積進而促進糖尿病腎臟肥大的進展，提示DN狀態(tài)下溶酶體的消化功能受損與疾病進展密切相關(guān)。

Figure 3.The effects of urinary proteins (UP) or AGE-BSA on enzymatic activity of CB and CL in the HK-2 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs control BSA.

Figure 4.The effects of urinary proteins (UP) or AGE-BSA on the degradation of DQ-ovalbumin in the HK-2 cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control； ##P<0.01 vs control BSA.

持續(xù)病理產(chǎn)物(如尿蛋白或AGE)作用下，腎小管上皮細胞損傷(凋亡和活化)。一方面，TECs過度凋亡部分導(dǎo)致了腎小管萎縮；另一方面， TECs活化后分泌各種生長因子激活了腎間質(zhì)的成纖維細胞而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，活化的 TECs還可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞又可分泌大量的細胞外膠原基質(zhì)加劇腎間質(zhì)纖維化，此外，TECs轉(zhuǎn)分化后穿破腎小管基底膜游走進入腎間質(zhì)，使TECs丟失而進一步加劇腎小管萎縮，最后，活化的TECs還可分泌各種趨化因子促使炎癥細胞向間質(zhì)浸潤。以上這些病理生理變化可能參與CKD患者腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化[2]。

本研究觀察了當(dāng)前2種最常見CKD疾病過程中所產(chǎn)的2種最經(jīng)典的病理產(chǎn)物對腎小管上皮細胞溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的影響，但仍然不足以全面說明CKD狀態(tài)下TECs溶酶體的變化情況，因為CKD狀態(tài)下還有許多病理產(chǎn)物，如白細胞介素[26]，或尿毒癥毒素[27]也都已被證實能對腎小管上皮細胞造成損害，它們是否也以相同方式造成TECs溶酶體損傷還有待進一步研究，而且它們之間作用是否疊加也值得進一步探討。

本研究結(jié)果證實了CKD狀態(tài)下病理產(chǎn)物尿蛋白及糖基化終產(chǎn)物等可導(dǎo)致腎小管上皮細胞溶酶體發(fā)生LMP等結(jié)構(gòu)性損傷和消化功能降低等功能性損傷，較充分地證實了CKD狀態(tài)下所產(chǎn)生的病理產(chǎn)物可能是腎小管-間質(zhì)進一步損傷的下游病因，阻止這些病理產(chǎn)物對溶酶體的損傷用以改善溶酶體功能將可能是延緩CKD進展的新思路。

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缺血性琥珀酸聚集通過線粒體ROS控制再灌注損傷

多種疾病尤其是心力衰竭和卒中時，某一器官血供被阻斷后血流再通會出現(xiàn)缺血再灌注損傷。對缺血組織再灌注是維系組織生存的必要措施，也會因此通過線粒體產(chǎn)生活性氧簇(ROS)而啟動氧化損傷、細胞死亡以及異常的免疫應(yīng)答過程。盡管已明確缺血再灌注損傷過程中線粒體會產(chǎn)生ROS，但目前普遍認為這是一種非特異性反應(yīng)。一組英美科學(xué)家采用體內(nèi)代謝產(chǎn)物比較分析方法，出乎意料地發(fā)現(xiàn)與缺血再灌注相關(guān)的線粒體ROS產(chǎn)生是一條廣泛存在的保守代謝通路。他們發(fā)現(xiàn)由三羧酸循環(huán)介導(dǎo)產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物琥珀酸的選擇性聚集是一個普遍存在于缺血性組織中的代謝標志物，并且是再灌注過程中ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵分子。嘌呤核苷酸降解和蘋果酸/天冬氨酸穿梭反應(yīng)的部分逆轉(zhuǎn)造成延胡索酸過多，并反過來促使琥珀酸脫氫酶逆轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致缺血性琥珀酸聚集。再灌注后，聚集的琥珀酸快速地被琥珀酸脫氫酶再氧化，通過逆轉(zhuǎn)線粒體復(fù)合體 I 中的電子轉(zhuǎn)運促進過多的ROS生成。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)用藥物抑制缺血性琥珀酸聚集能夠有效改善心力衰竭和卒中模型鼠的缺血再灌注損傷。該研究確認了組織對于缺血和再灌注的一種保守代謝反應(yīng)，從而統(tǒng)一了關(guān)于缺血再灌注不同方面的認識，并由此揭示了控制體內(nèi)ROS產(chǎn)生的新的代謝路徑，提示抑制缺血性琥珀酸聚集及再灌注后其氧化產(chǎn)物的生成將成為缺血再灌注損傷疾病的治療靶點。

Nature, 2014, 515(7527):431-435(麥鴻成)

Effect of urinary proteins and advanced glycosylation end products on lysosomes in renal tubular epithelial cells

DENG Jian-kun, WANG Shu-jun, WU Hong-luan, LUO Mian-na, XU Bi-hua, LIANG Dong, PAN Qing-jun, LIU Hua-feng, LIU Wei-jing

(InstituteofNephrology,TheAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China.E-mail:liuweijing-1977@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of pathological products, urinary proteins and advanced glycosylation end products (AGE) produced in the progression of chronic kidney disease (CKD), on the structure and function of lysosomes in renal tubular epithelial cells (TECs), and try to find a novel approach for preventing or delaying CKD. METHODS: The renal specimens of the untreated patients with minimal change nephrotic syndrome (MCNS), diabetic nephropathy (DN) or normal kidney were collected. The expression of lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1) and cathepsin B (CB) was studied in TECs by indirect immunofluorescent staining. Human renal tubular epithelial cell line HK-2 was incubated with 8 g/L urinary proteins or 100 mg/L AGE. The expression of LAMP1 and CB was investigated by indirect immunofluorescence and the activity of CB and cathepsin L (CL) was measured by biochemical and enzymatic assays.The degradation of DQ-ovalbumin was also determined. RESULTS: The lysosomal membrane permeabilization occurred in the TECs of MCNS and DN patients. After treatment with urinary proteins or AGE-BSA, the lysosomal membrane permeabilization of the HK-2 cells was increased. The activity of CB and CL and degradation of DQ-ovalbumin were decreased as compared with normal control group. CONCLUSION: The digestive function of lysosome was decreased and lysosomal membrane permeabilization occurred in the TECs exposed to urinary proteins and AGE, which might be a key factor to induce the tubulointerstitial fibrosis.

Tubular epithelial cells; Lysosome; Urinary proteins; Advanced glycosylation end products

1000- 4718(2015)03- 0505- 06

2014- 09- 18

2014- 12- 09

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270798)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. S2012040006276)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(No. A2014480)；湛江市科技攻關(guān)計劃(No. 2013B01056);廣東醫(yī)學(xué)科研基金(No,m2011009)

△通訊作者 Tel: 0759-2387164; E-mail: liuweijing-1977@hotmail.com

▲并列第1作者

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.021