鈣激活氯通道ANO1在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)及其功能鑒定*

侯毅鞠， 許會(huì)靜， 張雲(yún)喬， 扈昕虹， 郝 峰

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013)

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鈣激活氯通道ANO1在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)及其功能鑒定*

侯毅鞠， 許會(huì)靜， 張雲(yún)喬， 扈昕虹， 郝 峰△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013)

目的： 探討鈣激活氯通道蛋白anoctamin 1 (ANO1)在小鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中的表達(dá)及其功能特性。方法: 采用胰酶與膠原酶共同消化，聯(lián)合2次差速貼壁法獲得C57BL/6小鼠原代心肌細(xì)胞；并用免疫熒光染色法檢測(cè)α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白，以鑒定心肌細(xì)胞純度；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞ANO1 mRNA的表達(dá)；免疫印跡檢測(cè)ANO1蛋白在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)情況；應(yīng)用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ANO1鈣激活氯通道的功能特性。結(jié)果: RT-PCR結(jié)果表明原代培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞表達(dá)ANO1 mRNA。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞表達(dá)ANO1蛋白。 熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)于小鼠心肌細(xì)胞的ANO1具有鈣激活氯通道典型的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能特性。結(jié)論: ANO1在小鼠心肌細(xì)胞中有明確表達(dá)，并具有鈣激活氯離子通道特性，提示ANO1是鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)。

Anoctamin 1； 鈣激活氯離子通道； 心肌細(xì)胞

鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是心肌主要的氯離子通道之一，與心肌細(xì)胞的電活動(dòng)關(guān)系密切。CaCCs不僅參與心肌靜息電位的形成及動(dòng)作電位的復(fù)極化過(guò)程，并且在急性心肌缺血、再灌注、心力衰竭等病理狀態(tài)下，CaCCs異常激活，形成瞬間內(nèi)向電流，產(chǎn)生異常沖動(dòng)，從而導(dǎo)致心律失常發(fā)生。由此，推測(cè)CaCCs可能成為治療心律失常的新靶點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，anoctamin 1 (ANO1) 能夠是CaCCs的分子基礎(chǔ)，通過(guò)ANO1能夠產(chǎn)生Ca2+激活的Cl-電流，進(jìn)一步證實(shí)ANO1 蛋白是重要的CaCCs之一[1]。但是ANOl 蛋白是否在心肌表達(dá)，尤其是它是否作為心肌內(nèi)源性CaCCs發(fā)揮作用，目前還沒(méi)有明確研究結(jié)論。因此，在本研究中，我們以小鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫熒光化學(xué)方法以及熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，明確ANO1 在心肌細(xì)胞的表達(dá)，為深入研究該通道功能、明確與該通道相關(guān)各類疾病的機(jī)制、相關(guān)靶向治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6 新生乳鼠，雌雄不限，1～3日齡，1.2～1.5 g，由吉林大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要試劑

DMEM/F12基本培養(yǎng)基、胰蛋白酶、膠原酶、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠 II 抗以及焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)均購(gòu)自Sigma；anti-ANO1單克隆抗體及HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG 購(gòu)自 Santa Cruz；T16Ainh-A01購(gòu)自Millipore；新生牛血清購(gòu)自 Gibco； TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine LTX 為 Invitrogen產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 Fermentas產(chǎn)品；DL1000 DNA marker、dNTP、Taq DNA聚合酶是 TaKaRa產(chǎn)品；谷氨酰胺是武漢天源生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；異丙醇、氯仿是北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；真核表達(dá)載體 pcDNA 3.1 YFP H148Q / I152 L 為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，所用引物由上海生工合成。

3 主要方法

3.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取新生乳鼠心臟，剝離出心房部分組織，剪成 0.5～1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，加入0.125%胰酶與膠原酶，37 ℃水浴。10 min后棄上清液，再次加入消化酶繼續(xù)消化。15 min后終止消化，收集細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿進(jìn)行2次差速貼壁，盡可能除去非心肌細(xì)胞。2～3 d后細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，此時(shí)換培養(yǎng)液，細(xì)胞備用。

3.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定 倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)皿內(nèi)心肌細(xì)胞形態(tài)并拍照。4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，2% BSA溶液封閉后加入α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(1 ∶ 100)，濕盒4 ℃過(guò)夜。加入 Cy3 標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶500)，倒置熒光顯微鏡下(Olympus)觀察，計(jì)算心肌細(xì)胞純度并拍照。

3.3 RT-PCR檢測(cè)ANO1表達(dá) 第1次換液為3 d后，體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞呈現(xiàn)單層貼壁生長(zhǎng)并融合成片。倒出培養(yǎng)液，每一培養(yǎng)皿中加入1 mL TRIzol 試劑，按 TRIzol 總RNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。以總RNA為模板，oligo ( dt )為逆轉(zhuǎn)錄引物，在Super ScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，并以此cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[3]合成ANO1 引物序列，上游引物為5’-GGA CCT GGG CTA TGA GGT TCA G-3’，下游引物為5’-CAG CGC GTC CCC ATG GTA CTC-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物為5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT G-3’，下游引物為5’-ATC TCC TTC TGC ATC CTG TC-3’。 基因擴(kuò)增體系為94 ℃ 45 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。取RT-PCR產(chǎn)物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上(0.03% 溴化乙錠)電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4 免疫印跡檢測(cè)ANO1蛋白的表達(dá) 收集狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞，PBS沖洗3次，加入100 μL蛋白裂解液充分裂解，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液后煮沸變性，冷卻后凍存?zhèn)溆?。取變性蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后將分離好的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST對(duì)PVDF膜室溫封閉2 h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入兔抗鼠ANO1單克隆抗體(1∶100)4 ℃過(guò)夜。TBST緩沖液漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG II抗(1∶500)，室溫孵育1 h。免疫反應(yīng)完成后繼續(xù)用TBST洗膜，均勻加入化學(xué)發(fā)光底物到 PVDF 膜上，室溫孵育 1 min。于暗室中去除發(fā)光液，壓片，曝光 1 min，顯影、定影，采集圖像后分析ANO1蛋白的表達(dá)。

3.5 熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)簽定ANO1功能 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化傳代于黑壁透明的96孔板中，細(xì)胞數(shù)為每孔20 000，然后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，直到細(xì)胞長(zhǎng)成單層。將 Lipofectamine LTX 和pcDNA 3.1 YFP H148Q/I152L滴加入含有心肌細(xì)胞的培養(yǎng)板中，36 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察YFP黃綠色熒光表達(dá)情況。以PBS洗滌細(xì)胞，加入含有 ionomycin(5 μmol/L)的高 I-溶液，利用鈣激活氯通道對(duì)陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及YFP H148Q/I152L對(duì) I-敏感的特點(diǎn)，在Ca2+激活CaCCs后，應(yīng)用Fluostar 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)通過(guò)ANO1轉(zhuǎn)運(yùn)的I-，對(duì)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi) YFP H148Q 蛋白黃綠色熒光的淬滅，并且按照每個(gè)點(diǎn)5 s的速度連續(xù)測(cè)定14 s，獲取熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)曲線。實(shí)驗(yàn)設(shè)置ANO1特異抑制劑 T16Ainh-A01(10 μmol/L)溶液及不含ionomycin高 I-溶液作為對(duì)照，以此確定ANO1通道功能特性。

結(jié) 果

1 心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采用胰酶與膠原酶共同消化，聯(lián)合 2 次差速貼壁法獲得較多 C57BL/6 小鼠原代心肌細(xì)胞，見(jiàn)圖 1。

Figure 1.Mouse cardiomyocytes were isolated and cultured for 48 h (×200).

2 心肌細(xì)胞的純度鑒定

α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白染色陽(yáng)性心肌細(xì)胞見(jiàn)圖2，可觀察到明顯橫紋肌結(jié)構(gòu)。α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白染色陽(yáng)性率代表心肌細(xì)胞純度，為 95.81%。

Figure 2.Immunofluorescent staining of α-sarcomeric actin antibody (×400).

3 心肌細(xì)胞ANO1的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果表明，在 400 bp 附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符，見(jiàn)圖3。證實(shí)經(jīng)原代分離培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞在 mRNA 水平上有 ANO1 的表達(dá)，并且目的基因電泳條帶的灰度值與 β-actin 近似，表明小鼠心肌細(xì)胞中 ANO1 在mRNA 水平表達(dá)穩(wěn)定。

Figure 3.The mRNA expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes detected by RT-PCR.

4 ANO1 蛋白在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)

小鼠 ANO1 蛋白大小為150 kD，根據(jù) Western blotting 結(jié)果中蛋白marker 的位置，心肌細(xì)胞提取蛋白在分離膠相應(yīng)的位置上可見(jiàn)預(yù)期大小的清晰條帶， 證明小鼠心肌細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)ANO1，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes.

5 心肌細(xì)胞ANO1 的功能特性鑒定

YFP H148Q/I152L熒光淬滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ionomycin 可使胞漿中鈣離子濃度迅速升高，繼而引起 CaCCs 開(kāi)放，使細(xì)胞外溶液中高濃度的碘離子向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致 YFP 蛋白熒光強(qiáng)度迅速下降(圖 5 A)，表明 ANO1 具有內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn) I-的功能，符合 CaCCs 功能特點(diǎn)。對(duì)照組由于缺乏 ionomycin，即沒(méi)有Ca2+的激活作用，ANO1沒(méi)有開(kāi)放，所以YFP 蛋白熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，表明心肌細(xì)胞 ANO1 的激活的確與鈣離子密切相關(guān)，加入 ANO1特異抑制劑 T16Ainh-A01，YFP 蛋白熒光強(qiáng)度同樣無(wú)明顯變化，更進(jìn)一步明確心肌細(xì)胞內(nèi)流的碘是通過(guò) ANO1 實(shí)現(xiàn)的(圖5B)。上述結(jié)果一致表明，表達(dá)于小鼠心肌細(xì)胞的 ANO1 具有鈣激活和轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的特性，符合經(jīng)典 CaCCs，提示ANO1是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。

討 論

近年來(lái)，氯通道在心臟生理和病理過(guò)程中的作用已經(jīng)受到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。其中 CaCCs的動(dòng)力學(xué)特性是依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，進(jìn)而對(duì)心肌細(xì)胞電活動(dòng)產(chǎn)生直接影響。尤其是當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)，如急性心肌缺血再灌注、心力衰竭、心肌肥厚等可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，CaCCs通道異常激活，形成異常沖動(dòng)，導(dǎo)致心律失常[2]。2008年Nature[3]、Science[4]和Cell[5]同時(shí)報(bào)道，內(nèi)源性CaCCs通道是由ANO1蛋白構(gòu)成，這一發(fā)現(xiàn)為特定細(xì)胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關(guān)問(wèn)題及其作用機(jī)制提供了新的研究平臺(tái)。

Figure 5.ANO1 assay based on the halide-sensitive YFP H148Q/I152L in the mouse cardiomyocytes. A: representative trace showed cell fluorescence quenching upon the addition of extracellular I plus ionomycin in the cells stably expressing ANO1; B: representative trace of control group.

ANO1是跨膜蛋白 anoctamin(也稱作 TMEM 16)家族中的一員，其功能尚不明確。目前已證明，ANO1蛋白在各種分泌上皮(如氣管上皮，唾液腺上皮)、視網(wǎng)膜和感覺(jué)神經(jīng)元、胃腸道 Cajal 間質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌等均有表達(dá)[6-7]，且作為 CaCCs 通道發(fā)揮重要作用。此外亦有文獻(xiàn)顯示，ANO1 在頭頸部及胃腸道等腫瘤中表達(dá)增加，而且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切[8]。新近已有學(xué)者發(fā)表關(guān)于ANO1蛋白在心肌細(xì)胞表達(dá)的研究結(jié)論[9]，為此我們通過(guò)本研究進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，以確定ANO1作為心肌內(nèi)源性 CaCCs 所發(fā)揮的重要作用。我們以原代培養(yǎng)獲得 C57BL/6 小鼠心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，應(yīng)用 RT-PCR 檢測(cè)到小鼠心肌細(xì)胞 ANO1 在mRNA 水平穩(wěn)定表達(dá)，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)小鼠心肌細(xì)胞存在 ANO1 蛋白的表達(dá)。利用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證ANO1 蛋白的確具有 CaCCs 通道的功能特性。因此，我們認(rèn)為小鼠心肌細(xì)胞中的 ANO1 是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。本研究所獲得的結(jié)論能夠?yàn)?CaCCs 通道功能研究、心臟相關(guān)疾病機(jī)制的進(jìn)一步了解、抗心律失常及心肌保護(hù)藥物研發(fā)提供新靶點(diǎn)、新途徑和新方向。

目前，有關(guān)心臟氯通道的基因、分子結(jié)構(gòu)、通道特性和生理功能，以及通道在心律失常等病理狀態(tài)下作用的研究都取得了重大的進(jìn)步。但是，我們也清楚地看到由于通道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對(duì)于通道的調(diào)節(jié)機(jī)制仍存在很多的未知，都是目前亟待解決的問(wèn)題。因此，我們后續(xù)將在 ANO1 通道的分子結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)機(jī)制和特異性調(diào)控藥物等方面展開(kāi)相應(yīng)的研究。隨著研究水平的深入和科技的進(jìn)步，人類必將會(huì)逐步揭示氯通道在心律失常中的作用機(jī)制，并尋找到對(duì)疾病更為有意義的預(yù)防和治療方法。

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Expression and identification of ANO1 in mouse cardiomyocytes

HOU Yi-ju, XU Hui-jing, ZHANG Yun-qiao, HU Xi-hong, HAO Feng

(DepartmentofBiochemistryLaboratory,JilinMedicalCollege,Jilin132013,China.E-mail: 1208254922@qq.com)

AIM: To explore the expression of anoctamin 1 (ANO1), one of calcium-activated chloride channels (CaCCs), in mouse cardiomyocytes and its functional properties. METHODS: The cardiomyocytes from the myocardial tissues of C57BL/6 mice were isolated with enzyme and purified by the differential adherent method. The cells were stained with monoclonal anti-sarcomeric actin and Cy3 to evaluate the purity of the myocardial cells. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes. The protein expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes was determined by Western blotting analysis. The fluorescence quenching kinetics experiment was used to identify the ion transport properties of ANO1 in the mouse cardiomyocytes. RESULTS: The results of RT-PCR confirmed that ANO1 was expressed in freshly isolated myocardial cells. The results of Western blotting clearly demonstrated the protein expression of ANO1 in primarily cultured myocardial cells. Fluorescence quenching kinetics experiment on freshly isolated single myocardial cell revealed a pronounced outward rectifying property of the ANO1. The functional properties were similar to the classic CaCCs. CONCLUSION: ANO1 expression was identified in the mouse myocardial cells. The function of CaCCs was generated by ANO1, suggesting that ANO1 is the molecular basis of CaCCs.

Anoctamin 1; Calcium-activated chloride channels; Cardiomyocytes

1000- 4718(2015)03- 0539- 04

2014- 10- 22

2014- 11- 18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81202031)；吉林省教育廳基金資助課題(No. 2013351)；2014年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃；2013年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃；吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助課題(吉醫(yī)學(xué)科字[2012]第12號(hào))

△通訊作者 Tel: 0432-64560538; E-mail: 1208254922@qq.com

R337.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.027