高淑艷， 馮 濤

(勝利油田中心醫(yī)院呼吸內科，山東 東營 257034)

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丙戊酸鈉減輕博萊霉素致大鼠肺纖維化*

高淑艷， 馮 濤△

(勝利油田中心醫(yī)院呼吸內科，山東 東營 257034)

目的： 探討丙戊酸鈉在博萊霉素誘導的肺纖維化中的作用及機制。方法: 42只大鼠隨機分為正常對照組、模型組和治療組。造模采用博來霉素5 mg/kg氣管內注射，自造模14 d開始分別采用生理鹽水(0.5 mL/d)、丙戊酸鈉(300 mg·kg-1·d-1)和地塞米松(0.6 mg·kg-1·d-1)腹腔內注射治療14 d。模型組分別在造模后14 和、28 d處死。治療組在造模后28 d處死。然后通過HE染色、Masson染色、羥脯氨酸(HYP)檢測和Western blotting檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達的變化，綜合分析丙戊酸鈉對肺纖維化發(fā)展的干預作用。結果: HE染色顯示丙戊酸鈉治療組的肺泡結構、肺間質的形態(tài)優(yōu)于生理鹽水組和地塞米松治療組。Masson染色及HYP檢測用于衡量肺組織內膠原的分布及含量，可見丙戊酸鈉治療組肺組織內膠原的分布及含量均顯著低于地塞米松治療組及生理鹽水組。丙戊酸鈉可以降低α-SMA的表達，同時上調上皮標志性蛋白E-cadherin的表達。結論: 丙戊酸鈉可以通過減少膠原的表達與分布及下調間充質蛋白α-SMA，同時上調上皮蛋白E-cadherin的表達從而減輕博來霉素誘導大鼠肺纖維化。

肺纖維化； 博來霉素； 丙戊酸鈉； α-平滑肌肌動蛋白； E-鈣黏蛋白

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因不明的慢性進展性破壞性肺疾病，以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞灶形成和細胞外基質的過度沉積為特征[1]。特發(fā)性肺纖維化是間質性肺炎中最常見的一種，多見于中老年人，臨床多表現(xiàn)為刺激性咳嗽、進行性的呼吸困難，是一種慢性、進行性、致命性的間質性肺疾病，中位生存期為診斷后的2～3年，最終死于呼吸/循環(huán)衰竭。臨床上至今尚無有效的藥物可以逆轉或延緩該病的進展[2]。因此，通過研究肺纖維化發(fā)病及治療的相關分子機制對于進一步指導臨床用藥具有重要的意義。

近年來研究表明，上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)現(xiàn)象在肺纖維化發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，其中E-cadherin和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是EMT現(xiàn)象中的主要靶基因。E-cadherin的缺失會降低細胞之間的黏附性，同時增加細胞遷移性，促進EMT的發(fā)生；E-cadherin的過表達有助于逆轉EMT，即促進肺間質細胞轉化為肺泡上皮細胞[3]。α-SMA是最為常用的肌成纖維細胞的分子標志，在肺纖維化發(fā)生中肌成纖維細胞增殖表達α-SMA形成纖維細胞灶，最終引起肺泡結構破壞甚至肺硬化[4]。研究表明，吉非替尼可能通過抑制EGFR/Akt通路，增強轉錄因子Foxo3a活性，抑制上皮-間質轉分化，從而減輕博來霉素誘導的肺纖維化[5]。

丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)是一種組蛋白脫乙酰基轉移酶抑制劑，可以降低肝星形細胞內TGF-β的生成，減少TGF-β誘導的膠原合成，在纖維化性疾病的治療上具有潛在價值[6]。研究顯示，VPA可能通過下調組蛋白去乙?；?、8改善腎性高血壓大鼠腎臟纖維化[7]。而基于肺纖維化是長期慢性隱匿性炎癥的最終結局的理論，糖皮質激素以及其它免疫抑制劑(咪硫唑嘌呤等)是最先用于治療肺纖維化的主要藥物。糖皮質激素作用于免疫系統(tǒng)的體液和細胞免疫，降低促炎分子的水平，從而對抗炎癥誘發(fā)的肺纖維化[8]。本研究通過大鼠氣管內注射博萊霉素構建肺纖維化的動物模型，從而探索丙戊酸鈉對肺纖維化的治療機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與試劑

健康清潔級雄性SD大鼠42只，體重180～220 g，購自煙臺綠葉制藥有限公司實驗動物中心；博萊霉素購自勝利油田中心醫(yī)院；丙戊酸鈉購自Sigma；Masson染色試劑盒及羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司；α-SMA抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；E-cadherin抗體購自Santa Cruz。

2 實驗方法

2.1 動物分組及造模 SD大鼠(180～220 g)隨機分為正常對照組、模型組(14 d、28 d)、生理鹽水(normal saline，NS)組、VPA組和地塞米松(dexamethasone，DEX)組。飼養(yǎng)環(huán)境為潔凈級動物房，適應性喂養(yǎng)7 d，實驗期間大鼠自由飲水和進食。造模前用4%水合氯醛(0.1 mL/kg)麻醉大鼠，將大鼠背位固定于手術臺，無菌操作下做頸部正中切口，逐層暴露氣管，于氣管環(huán)間隙向心方向穿刺緩慢注入博來霉素5 mg/kg，注入藥物后，將大鼠直立旋轉2 min，使藥液在雙肺分布均勻，后縫合皮膚，放入鼠籠飼養(yǎng)。治療組自造模14 d開始分別采用生理鹽水(0.5 mL/d)、丙戊酸鈉(300 mg·kg-1·d-1)和地塞米松(0.6 mg·kg-1·d-1)腹腔內注射治療。模型組分別在造模后14 d、28 d處死取材，治療組在造模28 d即治療14 d后處死取材。取右肺，4%多聚甲醛固定，常規(guī)病理學方法脫水、包埋、切片，HE染色觀察形態(tài)學改變，Masson染色觀察膠原表達。取左肺凍存于液氮用于蛋白分析。

2.2 HYP檢測及Masson染色 均嚴格按照南京建成科技有限公司快速Masson染色說明書及羥脯氨酸測試盒說明書進行。Masson染色膠原陽性表達為藍色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行拍照隨機取3個不重疊視野進行積分吸光度(integral absorbance，IA)分析，半定量分析各組膠原的相對表達量。

2.3 免疫蛋白印記檢測E-cadherin及α-SMA蛋白表達 取100 mg凍存肺組織加入總蛋白提取液放入預冷研缽內研磨勻漿，后吸入EP管冰上裂解40 min，1 200 r/min離心10 min，取上清，加入1/4體積的5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，SDS-PAGE分離蛋白，蛋白轉至PVDF膜，7%脫脂奶粉封閉后，轉有蛋白的PVDF膜與 I 抗(E-cadherin 1∶200，α-SMA 1∶300)4 ℃孵育過夜，TBST清洗后與HRP標記的II抗孵育2 h，清洗后加ECL發(fā)光液顯影，在化學發(fā)光檢測系統(tǒng)中(Clinx Science Instruments)成像，并測其灰度值。以β-actin為內參照。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HE染色觀察VPA對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化形態(tài)學改變影響

正常對照組大鼠肺組織結構正常，無明顯炎癥細胞浸潤及膠原纖維增生；14 d模型組肺泡間質炎癥細胞浸潤，肺泡塌陷，間質膠原纖維增生，肺泡間隔增厚；28 d模型組肺泡炎癥明顯減輕，主要是成纖維細胞大量增生，間質大量膠原纖維沉積，明顯的纖維化樣改變。NS組在病理形態(tài)上同模型組28 d，肺泡結構破壞，肺泡間隔明顯增厚。VPA組及DEX組的肺泡形態(tài)較NS組的肺泡形態(tài)規(guī)則，間隔較NS組明顯變薄，其中以VPA組更為明顯，見圖1。

Figure 1.Histologic changes of the rat lung tissues (HE staining, the scale bar = 150 μm). A: control group; B: 14 d model group; C: 28 d model group; D: NS- group; E: VPA group; F: DEX group.

2 Masson染色觀察VPA對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化膠原分布及半定量IA分析大鼠肺組織內膠原含量的變化

0 d正常大鼠肺組織對照組，無明顯的膠原纖維的沉積，肺泡結構規(guī)則、整齊；博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化14 d模型組，藍色膠原沉積在肺泡間隔中彌漫分布，隨著造模時間延長，28 d模型組肺組織大量藍色膠原沉積于肺泡間隔及肺間質。VPA組及DEX組較NS組的藍色膠原沉積均有不同程度減輕，其中VPA組較DEX組的藍色膠原沉積減少更加明顯。采用Image-Pro Plus 6.0對膠原藍色陽性表達區(qū)進行IA分析，結果顯示隨著造模時間延長，肺組織內膠原含量明顯上升，VPA及DEX治療均可以明顯降低肺組織內膠原含量，其中VPA組較NS組及DEX組的膠原水平有顯著減低，各組差異均具有統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 2.The collagen contents in the rat lung tissues (Masson staining, the scale bar = 150 μm). A: control gorup; B: 14 d model group; C: 28 d model group; D: NS group; E: VPA group; F: DEX group.Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 14 d model; △P<0.05 vs NS； ▲▲P<0.01 vs VPA.

3 大鼠肺組織HYP含量檢測

大鼠肺組織中的HYP檢測結果顯示，隨著博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化造模時間的延長，肺組織內HYP的含量逐漸上升，各組比較均有統(tǒng)計學意義。VPA及DEX治療有助于降低大鼠肺組織內HYP的含量，其中VPA組效果明顯優(yōu)于DEX組，見圖3。

Figure 3.The hydroxyproline (HYP) contents in the rat lung tissues at different time points and with different treatments. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 14 d model; △△P<0.01 vs NS; ▲P<0.05 vs VPA.

4 Western blotting檢測大鼠肺組織內E-cadherin及α-SMA蛋白的表達

Western blotting實驗結果顯示，VPA組及DEX組的肺泡上皮標志性蛋白E-cadherin的表達較NS組增加，VPA組的E-cadherin增加更加明顯。相反，VPA及DEX治療均可以降低間充質肌成纖維細胞的標志性蛋白α-SMA的表達。分別對各治療組E-cadherin、α-SMA蛋白及內參照β-actin蛋白電泳條帶進行灰度分析，VPA組及DEX組較NS組可以明顯降低α-SMA，同時增加E-cadherin的表達，VPA組的治療效應較DEX組更為顯著，各組差異均具有統(tǒng)計學意義，見圖4。

Figure 4.The expression of E-cadherin and α-SMA determined by Western blotting. Mean±SD. n=7. *P<0.05, **P<0.01 vs NS; #P<0.05 vs VPA.

討 論

IPF是一種病因不明的慢性間質性肺疾病，目前為止，仍沒有有效的藥物可以減輕或逆轉該病的進程，因此闡明其發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，具有深遠的社會效應及現(xiàn)實意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮細胞損傷與異常修復導致纖維化可能是IPF的重要發(fā)病機制。針對損傷和異常修復過程中相關的基因及蛋白因子進行干預是當今研究IPF發(fā)病機理及治療的熱點。TGF-β是研究最為廣泛的一種促纖維化細胞因子，它的生物學效應廣泛，參與細胞生長、凋亡、分化、遷移等生理過程，尤其是可以通過增加細胞外基質的沉積促進損傷修復[9]。

組蛋白脫乙酰酶決定組蛋白的乙酰化狀態(tài)控制著基因的表達。前期實驗表明，組蛋白脫乙?；敢种苿￢PA，可以通過上調上皮標志性蛋白E-cadherin同時下調間質性蛋白α-SMA，減輕腎損傷誘導的腎纖維化[10]。Kee等[11]研究表明VPA可以通過降低相關的纖維化因子的表達水平，減輕DOCA-salt誘導的高血壓大鼠模型心肌肥厚及心肌纖維化。此外，Mannaerts等[12]發(fā)現(xiàn)VPA可以通過抑制肝星形細胞轉分化而減輕CCl4誘導的小鼠肝纖維化。本研究通過丙戊酸鈉腹腔內注射觀察VPA對博萊霉素誘導的肺纖維化的干預作用，通過比較發(fā)現(xiàn)VPA及DEX治療均可以降低博萊霉素誘導的肺纖維化，VPA治療更有助于肺泡維持正常的結構，減少肺泡破壞。Masson染色及HYP檢測發(fā)現(xiàn)VPA可以有效降低膠原的表達量，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)DEX治療。

纖維/肌纖維細胞的激活、細胞外基質的蓄積是纖維化性疾病發(fā)生發(fā)展的共同特點。肌成纖維細胞有3種來源，肺間質固有成纖維細胞的激活增生、EMT及循環(huán)中的骨髓源性成纖維細胞[13]。EMT現(xiàn)象作為肌成纖維細胞重要來源之一，有效阻斷或降低EMT現(xiàn)象的發(fā)生是纖維化疾病治療的新靶點。E-cadherin和α-SMA作為EMT現(xiàn)象中的標志性蛋白，被認為是評價肺纖維化發(fā)生及嚴重程度的重要指標。本研究通過博萊霉素氣管內注射成功建立大鼠肺纖維化模型，分別從病理形態(tài)、肺組織膠原含量檢測及纖維化發(fā)生的重要蛋白指標的表達分析不同層面，研究VPA對博萊霉素誘導的肺纖維化的干預作用。實驗表明，與NS及DEX干預組比較，VPA可以更顯著地降低肺間質內ECM蓄積，減少HYP及膠原的產(chǎn)生，降低間質相關蛋白的表達，上調肺泡上皮標志性蛋白的水平，有助于減輕博萊霉素誘導的大鼠纖維化。VPA在肺纖維化的治療中具有潛在的臨床價值，有待于進一步系統(tǒng)性的研究。

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VPA alleviates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

GAO Shu-yan, FENG Tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ShengliOilfieldCentralHospital,Dongying257034,China.E-mail:fengtao1972@163.com)

AIM: To investigate the effect of sodium valproate (VPA) on bleomycin-induced pulmonary fibrosis (PF) and its mechanism. METHODS: SD rats (n=42) were randomly divided into model group and treatment group. Bleomycin at dose of 5 mg/kg was intratracheally injected to establish a rat PF model. The rats in treatment group were given normal saline (NS, 0.5 mL/d), VPA (300 mg·kg-1·d-1) or dexamethasone (DEX, 0.6 mg·kg-1·d-1) via intraperitoneal injection from the 14th day to the 28th day after modeling. The rats in model group were sacrificed on 0 d, 14 day and 28 d after modeling . The rats in treatment group were killed at 14th day after treatment. The effects of VPA on PF were evaluated by HE and Masson staining. The hydroxyproline (HYP) content in the rat lung tissues was detected, and the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and E-cadherin was determined by Western blotting. RESULTS: HE staining showed that the alveolar structure and interstitial morphology in VPA group were better than those in NS group and DEX group. The level of collagen in VPA group was significantly lower than that in DEX group and NS group by determining the HYP content and Masson staining. VPA reduced the expression of α-SMA, a mesenchymal marker protein of PF, while increased the expression of epithelial marker protein E-cadherin. CONCLUSION: VPA reduces collagen content and distribution, and up-regulates the expression of the epithelial marker protein E-cadherin, while down-regulates mesenchymal marker protein α-SMA, thereby preventing the rat lung tissues from bleomycin-induced PF.

Pulmonary fibrosis; Bleomycin; Sodium valproate; α-smooth muscle actin; E-cadherin

1000- 4718(2015)03- 0552- 05

2014- 10- 27

2015- 01- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81273957)

△通訊作者 Tel： 0546-8776590; E-mail: fengtao1972@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.030