李 順， 黃品婕， 葛 緬， 甘小亮

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630； 2中山大學(xué)中山眼科中心麻醉科，廣東 廣州 510060)

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類胰蛋白酶通過激活PAR-2促進(jìn)腸黏膜上皮IEC-6細(xì)胞損傷*

李 順1， 黃品婕1， 葛 緬1， 甘小亮2△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630；2中山大學(xué)中山眼科中心麻醉科，廣東 廣州 510060)

目的： 觀察類胰蛋白酶(tryptase)對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞IEC-6的作用及機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、tryptase處理組、蛋白酶激活受體 2(PAR-2)抑制劑(FSLLRY-NH2，F(xiàn)S)處理組以及tryptase+FS處理組。采用MTT法檢測細(xì)胞生存率；測定分泌的乳酸脫氫酶(LDH)活性；Western blotting 測定PAR-2和cleaved-caspase 3的表達(dá)。結(jié)果: 與對(duì)照組比，100 μg/L和1 000 μg/L 類胰蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞生存率明顯降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，10 μg/L到1 000 μg/L類胰蛋白酶導(dǎo)致LDH的活性明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，100 μg/L和1 000 μg/L 類胰蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞的PAR-2及cleaved-caspase 3表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與1 000 μg/L tryptase處理組比較，F(xiàn)S能夠明顯增加細(xì)胞生存率、降低LDH活性及cleaved-caspase 3表達(dá)(P<0.05)。 結(jié)論: 類胰蛋白酶通過激活PAR-2促進(jìn)IEC-6細(xì)胞損傷，且這種損傷呈濃度依賴性。

類胰蛋白酶； 蛋白酶激活受體2； IEC-6細(xì)胞； 乳酸脫氫酶； Caspase 3

我們在既往研究中發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞激活釋放炎性介質(zhì)加重了小腸缺血-再灌注損傷進(jìn)程[1]。在眾多釋放的炎性介質(zhì)中，類胰蛋白酶約占1/4～1/2[2]，具有廣泛的生物活性，如導(dǎo)致高血壓病心肌纖維化[3]和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[4]等。

蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2, PAR-2)作為一種G蛋白偶聯(lián)膜受體，廣泛分布在胃腸道等臟器和組織中。同時(shí)，我們前期在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)抑制類胰蛋白酶能夠減輕小腸黏膜損傷，且類胰蛋白酶的變化與PAR-2的變化趨勢一致[5]。前期研究結(jié)果提示類胰蛋白酶可能通過PAR-2途徑導(dǎo)致小腸黏膜損傷，為了證實(shí)上述設(shè)想，本研究擬在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過直接阻斷PAR-2來觀察類胰蛋白酶對(duì)大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

IEC-6細(xì)胞系購于北京協(xié)和細(xì)胞庫。IEC-6細(xì)胞用含4.5 g/L高糖DMEM培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)5% FBS、10mg/L胰島素的混合培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～50代的細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)。

2 材料與試劑

DMEM-H、胎牛血清和0.25%胰酶(Gibco)；類胰蛋白酶(Promega)；PAR-2抑制劑FSLLRY-NH2(FS， Sigma)；MTT試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒和DMSO溶劑(KeyGEN)；PAR-2單克隆抗體(Santa Cruz)；Total-caspase 3、 cleaved-caspase 3單克隆抗體(CST)。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照(control)組、tryptase處理組、PAR-2抑制劑FS處理組以及tryptase+FS處理組。對(duì)照組用含1% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)。tryptase處理組分為4個(gè)終濃度組：1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L及1 000 μg/L；FS處理組給予FS使終濃度為400 μmol/L。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次。

3.2 MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測 IEC-6細(xì)胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔5 000個(gè)的密度接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度增至90%(約2.5×104/well)時(shí)，再予以相應(yīng)的藥物處理(培養(yǎng)液中含1% FBS)，每孔培養(yǎng)液體積為100 μL。每組復(fù)設(shè)4孔，每孔加入1×MTT (0.5 g/L) 試劑，在37 ℃孵育4 h；吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，用平板搖床搖勻10 min; 設(shè)置本底孔(完全培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞)，采用酶標(biāo)儀490 nm波長測定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)孔-A本底孔)/(A對(duì)照孔-A本底孔)×100%。

3.3 LDH活性檢測 IEC-6細(xì)胞用1 mL 0.25%胰酶消化后以每孔10 000個(gè)密度接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度增至90%(約5×104/well)，PBS洗板2次后再予以相應(yīng)的藥物處理(培養(yǎng)液中含1% FBS)；收集上清，在4 ℃、12 000 ×g的條件下離心15 min，每個(gè)樣本取50 μL用于后續(xù)檢測。依據(jù)LDH檢測試劑盒操作說明，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管和對(duì)照管后逐步進(jìn)行，最后于440 nm處測各檢測孔A值。

LDH活性(U/L)=(測定管A值-對(duì)照管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)×1 000。

3.4 Western blotting檢測PAR-2及cleaved-caspase 3的蛋白水平 IEC-6細(xì)胞使用胰酶消化后以每板4×105個(gè)的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度增至90%(約每板2×106個(gè))后進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理(處理組含1% FBS)。將培養(yǎng)板置于冰上，用冷PBS洗滌3遍，用全蛋白提取液刮取，超聲裂解后于12 000 ×g4 ℃ 離心15 min，取上清，進(jìn)行BCA蛋白定量后變性、上樣，分別采用10%和15% SDS-PAGE分離蛋白(200 V，45 min)。轉(zhuǎn)膜使用PVDF膜(100 V，60 min)。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入抗PAR-2的I抗(1∶500)和cleaved-caspase 3 、caspase 3的I抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)的II抗(1∶2 000，CST)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，曝光。膜用TBST洗滌后，改用抗β-actin的I抗按相同的方法繼續(xù)孵育，曝光。 所有Western blotting的 結(jié)果均用AlphaView 3.4.0.0進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析，各組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 類胰蛋白酶對(duì)IEC-6細(xì)胞生長的作用

Tryptase終濃度為1、10、100、1 000 μg/L時(shí)，IEC-6細(xì)胞的生存率分別為(98.0±7.8)%、(84.7±7.1)%、(56.5±14.9)%、(34.0±7.9)%。與對(duì)照組比，tryptase 100 μg/L組和1 000 μg/L組生存率均明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2 類胰蛋白酶對(duì)IEC-6乳酸脫氫酶釋放量的影響

10 μg/L tryptase組的LDH釋放量為(360±48)U/L，100 μg/L組為(588±60)U/L，1 000 μg/L組為(659±46)U/L，后2組與對(duì)照組相比，均有明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.LDH release from IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μg/L.

3 類胰蛋白酶對(duì)IEC-6細(xì)胞PAR-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，100 μg/L和1 000 μg/L tryptase濃度使得PAR-2的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression of PAR-2 in IEC-6 cells after treatment with tryptase for 12 h. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs 0 μg/L.

4 PAR-2抑制劑FS 對(duì)類胰蛋白酶致IEC-6損傷的作用

1 000 μg/L tryptase 明顯增加LDH的釋放量、降低細(xì)胞生存率及顯著增加cleaved-caspase 3的表達(dá)(P<0.05)。與1 000 μg/L tryptase組比較，使用400 μmol/L FS能夠拮抗1 000 μg/L tryptase引起的上述指標(biāo)改變(P<0.05)；與對(duì)照組比較，F(xiàn)S本身對(duì)上述3項(xiàng)指標(biāo)均無影響，見圖4、表1。

Figure 4.The expression of cleaved-caspase 3 in IEC-6 cells after treatment with tryptase (1 000 μg/L) and/ or FS(400 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs tryptase group.

表1 各處理組細(xì)胞生存率、LDH釋放量與對(duì)照組的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vstryptase group.

討 論

在小腸缺血-再灌注損傷期間，大量因素可導(dǎo)致肥大細(xì)胞激活并釋放大量生物活性物質(zhì)，包括組胺，5-羥色胺、肝素、趨化因子、過氧化物酶、類胰蛋白酶、胃促胰酶和羧肽酶等[6]。其中類胰蛋白酶具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，不僅促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集并釋放炎癥介質(zhì)[7]，而且增加微血管通透性并促進(jìn)新生血管形成[8]。Zhang 等[9]發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶促進(jìn)的炎癥細(xì)胞聚集及細(xì)胞凋亡在腹主動(dòng)脈瘤形成的病理生理過程中起到主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)隨著類胰蛋白酶濃度升高，體外培養(yǎng)的大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞IEC-6的生長率逐漸降低、LDH的釋放量逐漸增加、細(xì)胞凋亡增加，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，類胰蛋白酶具有對(duì)IEC-6細(xì)胞損傷作用，且具有濃度相關(guān)性，與既往研究報(bào)道類胰蛋白酶導(dǎo)致大腸黏膜細(xì)胞凋亡增加的結(jié)果一致[5]。

肥大細(xì)胞廣泛分布于消化道黏膜下層結(jié)締組織中的毛細(xì)血管及淋巴管周圍，其類胰蛋白酶的釋放是炎癥性腸道疾病的主要發(fā)病因素[10]。在正常腸黏膜組織中，其類胰蛋白酶的濃度在8.0～154.6 μg/g之間，但在過敏性腸道疾病中，類胰蛋白酶濃度升高至525 μg/g左右[11]，因此，本研究選擇類胰蛋白酶的量為1 μg/L～1 000 μg/L之間，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道選用的12 mg/L[12]，研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)類胰蛋白酶在腸黏膜損傷中的關(guān)鍵作用。

目前已發(fā)現(xiàn)4種PAR受體(PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4)，其中PAR-2能特異性被類胰蛋白酶和胰蛋白酶(trypsin)激活，而其它的PAR受體則被凝血酶(thrombin)激活。PAR-2分布廣泛，在胃腸道系統(tǒng)尤為豐富?，F(xiàn)已經(jīng)證明，PAR-2參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。Antoniak等[13]發(fā)現(xiàn)，敲除PAR-2能減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷。McLarty 等[3]報(bào)道類胰蛋白酶/PAR-2信號(hào)通路是高血壓狀態(tài)下心肌纖維化的重要發(fā)病機(jī)制。也有人在體外證實(shí)，通過激活PAR-2受體可使HepG2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高、cyclinD mRNA表達(dá)上調(diào)，加速HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)DNA合成，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[14]。王輝等[15]在研究炎性腸病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，其迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核中存在PAR- 1和 PAR- 2，它們激活后通過磷脂酶C和三磷酸肌醇通路參與進(jìn)行調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶抑制劑減輕小腸缺血-再灌注損傷并伴隨著PAR- 2表達(dá)的下調(diào)[5, 16]。這種伴隨現(xiàn)象使得我們有理由推測類胰蛋白酶/PAR-2 組成的信號(hào)通路可能在小腸缺血-再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用。本體外細(xì)胞研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，類胰蛋白酶刺激IEC-6細(xì)胞12 h后，PAR-2的表達(dá)上調(diào)，且與類胰蛋白酶濃度呈正相關(guān)。使用PAR-2的特異性抑制劑FSLLRY-NH2能逆轉(zhuǎn)tryptase對(duì)IEC-6細(xì)胞的損傷作用，值得提出的是，本研究發(fā)現(xiàn)PAR-2抑制劑FSLLRY-NH2本身對(duì)IEC-6細(xì)胞無明顯的生物學(xué)作用，與其在有類胰蛋白酶或者胰蛋白酶存在時(shí)，選擇性地競爭性抑制PAR-2受體有關(guān)[17]。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)類胰蛋白酶通過激活PAR-2受體，導(dǎo)致IEC-6細(xì)胞損傷。

[1] Huang P, Liu D, Gan X, et al. Mast cells activation contribute to small intestinal ischemia reperfusion induced acute lung injury in rats[J]. Injury, 2012, 43(8):1250-1256.

[2] Pejler G, Abrink M, Ringvall M,et al. Mast cell proteases[J]. Adv Immunol, 2007, 95:167-255.

[3] McLarty JL, Meléndez GC, Brower GL, et al. Tryptase/Protease-activated receptor 2 interactions induce selective mitogen-activated protein kinase signaling and collagen synthesis by cardiac fibroblasts[J]. Hypertension，2011, 58(2):264-270.

[4] Zeng X, Zhang S, Xu L, et al. Activation of protease-activated receptor 2-mediated signaling by mast cell tryptase modulates cytokine production in primary cultured astrocytes[J]. Mediators Inflamm, 2013, 2013:140812.

[5] Liu D, Gan X, Huang P, et al. Inhibiting tryptase after ischemia limits small intestinal ischemia-reperfusion injury through protease-activated receptor 2 in rats[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2012, 73(5):1138-1144.

[6] Schwartz LB, Austen KF. Enzymes of the mast cell gra-nule[J]. J Invest Dermatol, 1980, 74(5):349-353.

[7] Ribatti D, Nico B, Finato N, et al. Tryptase-positive mast cells and CD8-positive T cells in human endometrial can-cer[J]. Pathol Int, 2011, 61(7): 442-444.

[8] Yamagishi H, Mochizuki Y, Hamakubo T, et al. Basophil-derived mouse mast cell protease 11 induces microvascular leakage and tissue edema in a mast cell-independent manner[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 415(4): 709-713.

[9] Zhang J, Sun J, Lindholt JS, et al. Mast cell tryptase deficiency attenuates mouse abdominal aortic aneurysm formation[J]. Circ Res, 2011, 108(11): 1316-1327.

[10]Hamilton MJ, Sinnamon MJ, Lyng GD, et al. Essential role for mast cell tryptase in acute experimental colitis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(1): 290-295.

[11]Hagel AF, deRossi T, Zopf Y, et al. Mast cell tryptase levels in gut mucosa in patients with gastrointestinal symptoms caused by food allergy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2013, 160(4):350-355.

[12]Magarinos NJ, Bryant KJ, Fosang AJ, et al. Mast cell-restricted, tetramer-forming tryptases induce aggrecanolysis in articular cartilage by activating matrix metalloproteinase-3 and -13 zymogens[J]. J Immunol, 2013, 191(3):1404-1412.

[13]Antoniak S, Rojas M, Spring D, et al. Protease-activated receptor 2 deficiency reduces cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(11):2136-2142.

[14]鄭艷敏，謝立群，趙軍艷，等. PAR-2激動(dòng)劑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及Ca2+水平的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(12): 2371-2375.

[15]王 輝，黃美近，康 亮，等. 蛋白酶激活受體在炎性腸病大鼠模型迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核的表達(dá)及作用[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(5): 998-1003.

[16]Gan X, Liu D, Huang P, et al. Mast-cell-releasing tryptase triggers acute lung injury induced by small intestinal ischemia-reperfusion by activating PAR‐2 in rats[J]. Inflammation, 2012, 35(3):1144-1153.

[17]Al-Ani B, Saifeddine M, Wijesuriya SJ, et al. Modified proteinase-activated receptor-1 and -2 derived peptides inhibit proteinase-activated receptor-2 activation by trypsin[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002, 300(2):702-708.

Role of PAR-2 in tryptase mediated IEC-6 cell injury

LI Shun1, HUANG Pin-jie1, GE Mian1, GAN Xiao-liang2

(1DepartmentofAnesthesiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanOphthalmicCentre,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:ganxiaoliang@yeah.net)

AIM: To investigate the role of protease activated receptor-2 (PAR-2) in the process of tryptase mediated IEC-6 cell injury. METHODS: The rat intestinal epithelial cell line IEC-6 was treated with tryptase at different concentrations (1 μg/L, 10 μg/L, 100 μg/L and 1 000 μg/L) in the presence or absence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 for 12 h respectively. The cell survival rate was detected by MTT assay. The protein levels of PAR-2 and cleaved-caspase 3 were determined by Western blotting. The LDH activity was also measured. RESULTS: Compared with control group, the cell survival rates were significantly decreased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups, the LDH activities were significantly increased in 10 μg/L to 1 000 μg/L tryptase treated groups, and the protein levels of PAR-2 and cleaved caspase 3 were significantly increased in 100 μg/L and 1 000 μg/L tryptase treated groups (P<0.05). Compared with 1 000 μg/L tryptase treated group, the LDH activity and cleaved caspase 3 protein level were dramatically decreased while the survival rate was significantly increased in the presence of PAR-2 antagonist FSLLRY-NH2 (P<0.05). CONCLUSION: Tryptase induces IEC-6 cell injury in a dose-dependent manner by activating PAR-2.

Tryptase; Protease activated receptor-2; IEC-6 cells; Lactate dehydrogenase; Caspase 3

1000- 4718(2015)03- 0530- 04

2014- 08- 28

2014- 09- 28

廣州市科技計(jì)劃(No. 2014J4100172)；中山大學(xué)青年教師培育項(xiàng)目(No. 12ykpy37)

△通訊作者 Tel: 020-87331548; E-mail: ganxiaoliang@yeah.net

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.025