張曉東+李彩霞+王連春+王元忠

摘要：根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶基因GrAACT序列設(shè)計引物，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)從滇龍膽幼葉擴增該基因，并進行序列分析、原核表達和組織特異性分析。結(jié)果表明：GrAACT基因（登錄號KJ917163）開放閱讀框長 1 215 bp，編碼404個氨基酸；GrAACT蛋白相對分子質(zhì)量41.41 ku，pI值為6.25，屬于AACT蛋白家族成員，無信號肽，為疏水穩(wěn)定蛋白，主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲構(gòu)成；GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守結(jié)構(gòu)域：硫解酶N端結(jié)構(gòu)域（第12～272位氨基酸）、硫解酶C端結(jié)構(gòu)域（第282～402位氨基酸）、類硫解酶結(jié)構(gòu)域（第13～403位氨基酸）；在硫解酶C端結(jié)構(gòu)域中，包含硫解酶保守位點（第350～366位氨基酸）、硫解酶活性位點（第385～398位氨基酸）；滇龍膽GrAACT蛋白與長春花CrAACT蛋白親緣關(guān)系最近；GrAACT基因在大腸桿菌中表達的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為6741 ku；組織特異性表達分析結(jié)果表明，GrAACT基因主要在莖、根中表達。

關(guān)鍵詞：滇龍膽；乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶；基因克隆；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號： S184；R282.71；Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0094-05

收稿日期：2015-05-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：81260608）；國家科技支撐計劃（編號：2011BAI13B02-04）；云南省教育廳科學研究基金重點項目（編號：2015Z171）。

作者簡介：張曉東（1980—），男，河南新鄭人，博士，副教授，從事植物代謝基因工程研究。E-mail：zxd95@126.com。

通信作者：王元忠，碩士，助理研究員，從事藥用植物資源評價與利用的研究。E-mail：boletus@126.com。滇龍膽是傳統(tǒng)中藥龍膽的來源植物之一，也是云南省重要道地藥材，主要分布于中國西南部，尤其是云南省山區(qū)地帶；其根入藥，用于治療各種炎癥、肝炎、風濕病和膽囊炎等[1]。目前，醫(yī)用龍膽需求量每年遞增約10%，而現(xiàn)有滇龍膽產(chǎn)量低、品質(zhì)不高，且野生滇龍膽資源遭到人為大肆采挖[2]。為選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高抗新品種，2013年6月云南省已啟動龍膽草航天育種工程[3]。從中醫(yī)藥現(xiàn)代化角度來看，滇龍膽主要藥效成分為龍膽苦苷，要從根本上解決龍膽草藥源問題并保護野生滇龍膽，除篩選新品種之外，還必須弄清龍膽苦苷的生物合成途徑及其調(diào)控機理，為通過基因工程手段生產(chǎn)龍膽苦苷奠定基礎(chǔ)。

龍膽苦苷為裂環(huán)烯醚萜類化合物，在植物中主要通過質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）、胞質(zhì)甲羥戊酸（MVA）途徑合成[4]。乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶（又稱乙酰乙酰CoA硫解酶，AACT，EC 2.3.1.9）是MVA途徑中的第1個限速酶，能夠催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[5]。目前，乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因AACT已從擬南芥[5]、丹參[6]、胡蘿卜[7]、白木香[8]、油茶[9]等許多植物中分離。AACT基因表達具有組織特異性，并被生物、非生物因素誘導。擬南芥中存在2個平行進化的同源基因，其中AtAACT1主要在維管系統(tǒng)中表達，AtAACT2則在根尖、幼葉、莖上部和花藥中大量表達，二者存在功能冗余；AtAACT2的作用是為胞質(zhì)定位、MVA起源的異戊烯萜類生物合成途徑合成大量乙酰乙酰CoA前體[5]。在生物誘導劑（100 mg/mL酵母提取物）、非生物誘導劑（30 mmol/L Ag+）共同誘導下，丹參SmAACT基因在誘導后12 h的表達量達到最高值[10]。

目前，由于龍膽基因組資源極度匱乏[11]，導致龍膽苦苷生物合成途徑并不清楚[3]。本研究根據(jù)筆者實驗室滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的GrAACT基因序列，設(shè)計特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)成功從滇龍膽幼葉中擴增到GrAACT基因，并進行序列分析、原核表達和組織表達特異性分析，以期為闡明滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

滇龍膽組培苗、盆栽苗均采自玉溪師范學院分子生物學實驗室，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl）。基因克隆所用材料為滇龍膽無菌苗幼葉，基因組織特異性表達分析所用材料為盆栽3年生滇龍膽的根、莖、葉，采樣日期為2014年5月17日。

1.2方法

按照多糖植物組織提取試劑RNAiso（TaKaRa，大連）說明書提取滇龍膽幼葉總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書合成cDNA。根據(jù)原核表達載體pGEX-4T-1多克隆酶切位點和筆者所在實驗室前期測序的滇龍膽轉(zhuǎn)錄組GrAACT基因序列，設(shè)計1對特異引物GrAACT BamHⅠ-F、GrAACT XhoⅠ-R（表1）。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：0.5 μL TransTaq Taq DNA Polymerase High Fidelity（2.5 U/μL，北京全式金生物技術(shù)有限公司），5 μL 10×TransTaq HiFi Buffer Ⅱ，4 μL dNTP（2.5 mmol/L，TaKaRa，大連），2 μL模板，各1 μL正反向引物（10 μmol/L），加dd H2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.5 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后割膠，使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國）對目的片段進行回收，將其連接到pMD19-T載體（TaKaRa，大連）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（TaKaRa，大連）后進行藍白斑篩選，挑取12個白斑搖菌；使用試劑盒提取質(zhì)粒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），經(jīng)酶切檢測正確后進行測序[生工生物工程（上海）股份有限公司]，獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrAACT。

1.2.1GrAACT基因的生物信息學分析用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序進行序列比對，用Genetyx 6.1.8進行翻譯，用DNAMAN 7進行多序列比對，用Clustal X2.1進行比對，然后用MEGA 6.0軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，設(shè)置Bootstrap=1 000；利用在線數(shù)據(jù)庫（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html）進行稀有密碼子分析。用ChloroP服務(wù)器v1.1進行葉綠體轉(zhuǎn)運肽預測；用Interpro軟件進行保守結(jié)構(gòu)域預測；用ProtScalee軟件進行疏水性分析；用PredictProtein對二級結(jié)構(gòu)進行預測；用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對三級結(jié)構(gòu)進行預測；用Expasy中的TMHMM工具預測蛋白的跨膜螺旋區(qū)；用在線工具WOLF PSORT預測蛋白的亞細胞定位情況。

1.2.2GrAACT基因的熒光實時定量分析分別取3年生滇龍膽的根、莖、葉，提取總RNA，用DNase I處理除去基因組DNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）合成第1鏈cDNA。以轉(zhuǎn)錄組中GrGAPDH基因（GenBank登錄號KM061807）作為內(nèi)參設(shè)計特異性引物（表1），PCR條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s。根據(jù)GrAACT基因開放閱讀柜（ORF）序列設(shè)計特異性引物（表1），使用SuperReal PreMix Plus試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進行qPCR，擴增條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s；每個反應(yīng)重復3次。反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）上進行擴增，擴增曲線、溶解曲線、標準曲線由定量PCR儀軟件自動生成。使用內(nèi)參基因GrGAPDH表達校準后，計算根、莖、葉中GrAACT基因的相對表達量。采用比較CT值的“2-ΔΔCT”的方法進行定量數(shù)據(jù)的分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1滇龍膽GrAACT基因的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用表1中的基因特異性引物GrAACTBamHI-F、GrAACTBamHI-R擴增出約 1 200 bp 的片段，詳見圖1。通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒 pMD19-GrAACT。

2.2GrAACT基因的生物信息學分析

2.2.1GrAACT基因的ORF分析和多序列比對分析利用Genetyx軟件對GrAACT基因的ORF序列進行分析，結(jié)果顯示：該基因（GenBank登錄號KJ91716）長1 215 bp，編碼404個氨基酸。利用GenBank數(shù)據(jù)庫的BLASTp程序?qū)rAACT蛋白進行比對分析，結(jié)果表明：滇龍膽GrAACT蛋白與長春花CrAACT蛋白的序列相似性最高（88.61%），與單子葉植物玉米ZmAACT蛋白的相似性（78.55%）稍低。利用DNAMAN 7將GrAACT蛋白序列與NCBI中相似性較高的部分序列進行多序列比對分析，結(jié)果表明：GrAACT蛋白與已知蛋白序列相比保守性較高（圖2）。利用Mega 6.0將GrAACT氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示：滇龍膽GrAACT蛋白與長春花CrAACT蛋白處于同一進化支（圖3），表明二者親緣關(guān)系較近。

2.2.2GrAACT蛋白的理化特性分析使用ExPASy ProtParam tool對GrAACT蛋白進行分析，結(jié)果表明：GrAACT蛋白單體相對分子質(zhì)量為41 410 u，pI值為6.25，這與丹參SmAACT蛋白[6]、油茶CoAACT蛋白[9]、擬南芥ATAACT2蛋白[5]類似；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）數(shù)為36個，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）數(shù)為38個，化學式為：C1812H2959N509O562S17；不穩(wěn)定指數(shù)為27.92，屬穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為9856，總平均疏水性（GRAVY）為0.178，為疏水蛋白（圖4）。GrAACT蛋白含20種基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，為13.9%；其次是甘氨酸、纈氨酸，含量分別為11.9%、9.9%；色氨酸含量最低，為0.5%。

2.2.3GrAACT蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)分析利用SSpro方法對GrAACT蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占39.11%，無規(guī)則卷曲（C）占40.10%，延伸帶（E）占20.79%。利用Swiss-Model Workspace的自動模式預測GrAACT蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5，該模型以人線粒體乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶[2f2s.1.C]為模板，在第13—404位氨基酸處建模，序列相似度為52.73%。

2.2.4GrAACT蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析使用InterPro在線工具對GrAACT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果表明：GrAACT

蛋白包含3個保守結(jié)構(gòu)域，它們分別為硫解酶N端結(jié)構(gòu)域（IPR020616，第12—272位氨基酸）、硫解酶C端結(jié)構(gòu)域（IPR020617，第282—402位氨基酸）、類硫解酶結(jié)構(gòu)域（IPR016039，第13—403位氨基酸）（圖6）。在硫解酶C端結(jié)構(gòu)域中，包含硫解酶保守位點（THIOLASE_2，第350—366位氨基酸）、硫解酶活性位點（THIOLASE_3，第385—398位氨基酸）。

2.2.5GrAACT蛋白信號肽分析利用ExPASy SignalP 4.1服務(wù)器分析GrAACT蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM工具預測GrAACT蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明：GrAACT蛋白不含有跨膜區(qū)域（圖7）。

2.2.6GrAACT蛋白亞細胞定位分析使用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位分析，結(jié)果表明，GrAACT蛋白在細胞質(zhì)、葉綠體、過氧化物酶體的定位系數(shù)分別為6.0、4.0、3.0。

2.2.7GrAACT基因稀有密碼子分析使用在線軟件對GrAACT基因進行稀有密碼子分析，結(jié)果表明：GrAACT基因中稀有密碼子占1.48%，且無二聯(lián)或三聯(lián)稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)的情況，因此可選用大腸桿菌表達菌BL21或Rosetta（DE3）進行原核表達。

2.3GrAACT基因原核表達載體的構(gòu)建

使用酶切檢測重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrAACT，結(jié)果表明：BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切可切出目的基因和載體，且二者長度之和等于XhoⅠ單酶切產(chǎn)物長度（圖8），表明GrAACT基因已成功插入載體pGEX-4T-1。

2.4GrAACT基因的原核表達

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrAACT轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）后，在37 ℃、1 mmol/L IPTG（終濃度）下，分別

誘導表達0、2、4、6 h后，提取細菌總蛋白進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明：與對照（第1～3泳道）相比，pGEX-4T-1-GrAACT轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導后，在相對分子質(zhì)量67 410 u（含GST蛋白26 000 u）左右有1條蛋白條帶，并且隨誘導時間增加，其蛋白含量逐漸升高（圖9），表明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrAACT在大腸桿菌Rosetta（DE3）中成功誘導表達了GrAACT蛋白。當溫度為37 ℃、誘導時間為6 h時，蛋白表達量最大（圖9），細胞破碎后可直接用于蛋白純化。

2.5GrAACT基因的組織表達分析

取3年生滇龍膽的根、莖、葉，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過實時熒光定量RT-PCR分析GrAACT基因在根、莖、葉中的表達情況。圖10結(jié)果表明：GrAACT基因在莖中表達量最高，分別約為葉、根的13.17、1.36倍，表達量最低的是葉。

3討論

滇龍膽藥效成分龍膽苦苷是通過MVA、MEP途徑合成的，在前期筆者已經(jīng)克隆了MEP途徑關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因GrDXR[12]。為闡明龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機理，本研究克隆了MVA途徑中的GrAACT基因。AACT是MVA途徑的第1個催化酶，因此滇龍膽中GrAACT基因的表達情況可以直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。研究表明，植物中如丹參[6]、白木香[8]、油茶[9]AACT蛋白均包含硫解酶N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和保守位點。本研究從滇龍膽幼葉中克隆獲得GrAACT基因，其編碼蛋白序列比對分析結(jié)果表明，GrAACT蛋白屬于AACT家族蛋白，具有硫解酶N端、C端結(jié)構(gòu)域，并且在其C端具有保守位點：NVHGGAVALGHPLGCSG（第350—366位氨基酸）。這些結(jié)果表明，所克隆基因的確為滇龍膽乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因。

根據(jù)底物鏈長特異性，硫解酶被分為2類：第I類是降解型硫解酶（EC 2.3.1.16），定位于線粒體、過氧化物酶體，在脂肪酸氧化中催化3-酮脂酰CoA斷裂產(chǎn)生乙酰乙酰CoA、縮短的?；鵆oA；第Ⅱ類是合成型硫解酶（EC 2.3.1.9），定位于細胞質(zhì)，能夠催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[13]。生物信息學分析結(jié)果表明，GrAACT蛋白定位于細胞質(zhì)，屬于Ⅱ型硫解酶，參與胞質(zhì)中的MVA途徑。在植物中，AACT蛋白的定位還存在爭議。在擬南芥中，參與MVA生物合成途徑的AtAACT2蛋白定位于細胞質(zhì)[14]；而對擬南芥過氧化物酶體蛋白質(zhì)組研究結(jié)果表明，該蛋白也存在于過氧化物酶體[15]。在向日葵（Helianthus annuus）乙醛酸循環(huán)體中，HaAACT能夠催化朝向乙酰乙酰CoA方向的反應(yīng)[16]，說明過氧化物酶體中也存在AACT。GrAACT蛋白三維模型預測結(jié)果表明，該蛋白的活性形式為四聚體。在本研究中，GrAACT單體相對分子質(zhì)量為41 410 u，其活性形式可能是單體，也可能是四聚體，這需要通過非變性SDS-PAGE進行進一步檢測。

在擬南芥中，參與MVA途徑的AtAACT2基因在根尖、幼葉、莖上部和花藥中大量表達[5]。組織表達特異性檢測結(jié)果表明，GrAACT基因在根中的表達量較高，因此推測：滇龍膽根部為龍膽苦苷生物合成的主要器官。滇龍膽用藥部分為根，因為與葉、莖相比，根中龍膽苦苷含量最高[17-18]，這也為上述假說提供了證據(jù)。在擬南芥中，參與MVA途徑的AtAACT2基因是多效基因。首先，AtAACT2對于胚胎形成和正常的雄性配子傳遞是必需的，AtAACT2突變體不能存活；其次，AtAACT2基因的RNAi株系表現(xiàn)出多效的表型，包括減弱的頂端優(yōu)勢、延長的生活周期和開花時間、雄性不育、矮化、種子產(chǎn)量降低、根長變短和植物甾醇類質(zhì)和量的改變等；再次，當外源添加甲羥戊酸后，AtAACT2基因的RNAi株系以上的表型和生化改變都可逆轉(zhuǎn)[5]。本研究中的GrAACT蛋白與AtAACT2蛋白相似性高達83.87%，GrAACT基因是否也為多效基因，需要進一步試驗驗證。

本研究為滇龍膽的分子生物學研究提供基因資源，并為GrAACT基因功能的解析奠定基礎(chǔ)。下一步將對GrAACT蛋白進行純化和酶活分析，通過互補試驗或過表達研究GrAACT基因的功能，從而為龍膽苦苷生物合成途徑的闡明奠定基礎(chǔ)。

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