袁 平，王麗麗，王 嵐，趙勤華，姜 蓉，宮素崗，劉錦銘*

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硫化氫供體對低氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞小窩蛋白的影響

袁 平1，王麗麗2，王 嵐1，趙勤華1，姜 蓉1，宮素崗1，劉錦銘1*

（1同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院肺循環(huán)科，上海 200433；2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310003）

探討硫化氫供體硫氫化鈉（NaHS）對低氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞小窩蛋白1（Cav-1）的影響。采用間斷常壓低氧法建立低氧大鼠模型。利用混合氣體培養(yǎng)法制備大鼠低氧肺動脈平滑肌細(xì)胞模型。將32只SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組8只）：常氧組、低氧組、常氧＋NaHS組和低氧＋NaHS組。免疫組織化學(xué)方法檢測肺小動脈中膜厚度、肌化及增殖程度。采用熒光探針法檢測活性氧（ROS）含量。蛋白免疫印跡法檢測Cav-1的表達(dá)。低氧組大鼠右心室收縮壓、右心室質(zhì)量指數(shù)、肺小動脈中膜厚度、肌化及平滑肌增殖程度明顯增加；低氧組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加及Cav-1表達(dá)降低；NaHS給予大鼠可改善肺動脈血流，緩解肺動脈中膜增厚，抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，減少肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生及增加Cav-1表達(dá)。NaHS可通過降低低氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生，上調(diào)Cav-1表達(dá)，抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，緩解肺動脈重構(gòu)。

大鼠；低氧；肺動脈；肌細(xì)胞，平滑肌；硫氫化鈉；小窩蛋白；增殖

低氧性肺動脈高壓是臨床許多心肺疾病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨或最終的重要病理生理過程。肺血管收縮和肺動脈壓力升高是低氧性肺動脈高壓的始動環(huán)節(jié)和主要病理過程，后期以肺血管重構(gòu)為主要病理生理改變[1,2]。因此，尋找抑制或緩解肺動脈重構(gòu)的新靶點(diǎn)或許能給低氧性肺動脈高壓提供新的治療方法。肺臟是機(jī)體氣體交換及代謝的重要場所，氣體信號分子對肺循環(huán)的影響具有非常重要的意義。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是新近發(fā)現(xiàn)的一種新型氣體信使分子，具有舒張血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用[3]。既往研究提示低氧性肺動脈高壓大鼠血漿H2S濃度顯著下降[4]。隨后同一課題組發(fā)現(xiàn)外源性H2S可緩解低氧性肺動脈高壓大鼠的肺動脈高壓[5]。但是H2S發(fā)揮保護(hù)作用具體機(jī)制仍然不是完全清楚。此外，我們新近研究結(jié)果表明低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞小窩蛋白（caveolin-1，Cav-1）表達(dá)顯著降低[6]。那么H2S是否通過調(diào)節(jié)Cav-1發(fā)揮緩解低氧性肺動脈重構(gòu)作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察H2S的供體硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1的影響及對血管重構(gòu)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量180～220g（上海斯萊克有限公司動物房）。DMEM高糖培養(yǎng)基（Sigma公司，批號：EE37812）；胎牛血清（Gibco澳洲血清，批號：10099-141）；EDTA（上海華美生物工程有限公司）；5?溴?2￠?脫氧尿嘧啶細(xì)胞增殖ELISA（密理博中國有限公司，批號：NG1758228）；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（浙江省聯(lián)科生物科技有限公司，批號：SPO735）；細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（江蘇省碧云天生物科技有限公司，批號：S0033）；小鼠抗大鼠Cav-1單克隆抗體（美國CST公司，批號：31-073）。

1.2 動物模型建立

SD大鼠32只隨機(jī)分為4組（＝8）：常氧組、低氧組、常氧＋NaHS組、低氧＋NaHS組。將低氧組和低氧＋NaHS組大鼠置于常壓低壓氧艙內(nèi)（含10%氧氣，90%氮?dú)猓┟刻斐掷m(xù)6h，共4周。對常氧＋NaHS組及低氧＋NaHS組大鼠常氧或低氧處理3周后，每天常氧或低氧前NaHS[50μmol/（kg·d）]腹腔注射從第4周開始，共7d；常氧組及低氧組注射生理鹽水。4組大鼠生活條件和飼料條件均相同自由攝食和飲水，光照為亮/暗12h交替，溫度、濕度和通風(fēng)符合該動物房動物管理?xiàng)l例。

1.3 原代培養(yǎng)肺動脈平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞模型制備

采用酶消化法培養(yǎng)原代肺動脈平滑肌細(xì)胞。取150～180g SD健康雄性大鼠，開胸取肺，鏡下剝離肺動脈，去掉血管周圍組織及血管外膜及內(nèi)膜，將肺動脈置于酶消化液中，37℃消化20min，離心棄上清，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸吹打，接種于培養(yǎng)皿中，24h后換液。取3～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將肺動脈平滑肌細(xì)胞分為4組（＝12）：常氧組，低氧組（5%O2，5%CO2），常氧＋NaHS組，低氧＋NaHS組（30μmol/L）培養(yǎng)48h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠右心室收縮壓測定及右心室質(zhì)量指數(shù)檢測

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用6%的水合氯醛（1.2ml/100g）麻醉大鼠，采用右心導(dǎo)管法檢測右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）[7]。測定完后，取出大鼠心臟，剪掉心房，分離右心室和左心室＋室間隔，濾紙吸干稱其濕重，計算右心室質(zhì)量指數(shù)（right ventricular mass index，RVMI）[7]。

1.5 肺血管形態(tài)學(xué)改變

左肺葉經(jīng)10%甲醛（中性福爾馬林）溶液固定后，將標(biāo)本嚴(yán)格于垂直位石蠟包埋，垂直于支氣管細(xì)支氣管斷面，矢狀位取材，沿肺門橫斷取材，連續(xù)切片，切片厚度5μm。切片用蘇木素?伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色（α-SM-actin）。血管中膜厚度計算公式：中膜厚度（%）＝血管壁厚度/血管外膜直徑×100，每張切片觀察30根血管外徑約50～100μm的血管。顯微鏡400倍鏡下觀察100根血管外徑約為10～50μm的小肺動脈，觀察血管肌化程度[8]。

1.6 肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖檢測

采用PCNA檢測試劑盒檢測肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖程度。肺動脈中PCNA表達(dá)的陽性信號為細(xì)胞漿呈棕黃色染色。每只大鼠選擇血管外徑為20～100μm的血管各30條。光學(xué)顯微鏡下檢測。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測定

采用ROS檢測試劑盒測定平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。各組細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)在96孔板中48h，然后按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行ROS檢測。

1.8 Western印跡法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

取等量已變性處理的細(xì)胞蛋白，采用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上（280mA，90min），用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫?fù)u動封閉2h，加入Cav-1蛋白一抗（1∶1000），4℃過夜，室溫下洗膜3次后加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗（1∶2000），室溫孵育1h，洗膜3次，加化學(xué)發(fā)光物于膜上，反應(yīng)3min顯影。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析處理數(shù)據(jù)，計算灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NaHS對大鼠RVSP、RVMI及肺動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

與常氧組相比，低氧組大鼠RVSP顯著升高，RVMI明顯增加，光鏡下該組大鼠肺小動脈管壁明顯增厚，血管肌化程度顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均＜0.01）；NaHS治療可逆轉(zhuǎn)這些現(xiàn)象，即低氧＋NaHS組大鼠RVSP和RVMI較低氧組顯著降低，肺小動脈管壁明顯變薄，肌化程度顯著降低（均＜0.01）；常氧＋NaHS組大鼠這些指標(biāo)與常氧組大鼠類似，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與常氧＋NaHS組相比，低氧＋NaHS組大鼠RVSP、RVMI、血管中膜厚度及肌化程度均顯著增加（均＜0.05；表1，圖1）。

2.2 NaHS對大鼠肺動脈平滑肌增殖的影響

圖2結(jié)果表明，常氧組和低氧組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞PCNA陽性率分別為（10.70±1.31）%和（24.85±2.57）%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與低氧組大鼠相比，低氧＋NaHS組大鼠平滑肌細(xì)胞增殖[（16.35±1.98）%]明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；常氧＋NaHS組大鼠平滑肌細(xì)胞增殖（12.90±1.35）%與常氧組大鼠類似，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與常氧＋NaHS組大鼠相比，低氧＋NaHS組大鼠平滑肌細(xì)胞增殖顯著增加（＜0.05）。

2.3 NaHS對肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS含量的影響

與常氧組比較，低氧處理組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生百分率顯著增加[（99.65±6.58）%（177.74±7.45）%，＜0.05]；低氧＋NaHS組（140.80±9.41）%與低氧組相比可明顯抑制ROS的釋放（＜0.05）；與常氧＋NaHS組（108.28±8.16）%相比，低氧＋NaHS組ROS釋放增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05；圖3）。

2.4 NaHS對肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1的影響

常氧組和低氧組肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)相對量分別是（1.12±0.18）和（0.57±0.15），兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；低氧＋NaHS組平滑肌細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)（0.77±0.11）較低氧組顯著增加（＜0.05），但仍比常氧＋NaHS組（1.08±0.20）Cav-1蛋白表達(dá)低（＜0.05）；類似于上述結(jié)果，常氧＋NaHS組與常氧組肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；圖4）。

3 討 論

低氧性肺血管重構(gòu)是低氧性肺動脈壓力持續(xù)性升高的主要原因之一。血管重構(gòu)主要由血管收縮物質(zhì)和舒張物質(zhì)失衡，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞紊亂和增殖、凋亡抑制、炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)聚集、血栓形成等引起的[9]。目前研究選擇與肺動脈重構(gòu)和右心室肥厚的相關(guān)指標(biāo)來探討NaHS對肺動脈平滑肌增殖的影響機(jī)制。前期已有文獻(xiàn)報道在大鼠低氧性肺動脈高壓時，機(jī)體內(nèi)源性H2S體系下調(diào)，補(bǔ)充H2S對低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓和肺動脈重構(gòu)有明顯的緩解作用[4,10]。我們的研究與這兩項(xiàng)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)外源性補(bǔ)充H2S供體NaHS可改善低氧性肺動脈高壓大鼠的RVSP， RVMI，肺動脈重構(gòu)。我們采用更加客觀的肺血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)即肺動脈中膜厚度和血管肌化程度來體現(xiàn)肺動脈重構(gòu)的改變。

表1 4組大鼠血流動力學(xué)和肺動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較

RVSP: right ventricular systolic pressure; RVMI: right ventricular mass index. 1mmHg＝0.133kPa. Compared with normoxia group,**＜0.01; compared with hypoxia group,##＜0.01; compared with normoxia＋NaHS group,△＜0.05

圖1 4組大鼠肺動脈HE染色和α-SM-actin表達(dá)情況

Figure 1 HE staining and expression of α-SM-actin in pulmonary artery of four groups of rats A?D: HE staining; E?H: expression of α-SM-actin

圖2 4組大鼠肺動脈PCNA陽性表達(dá)的比較

Figure 2 Comparison of PCNA positive expression in pulmonary artery between four groups of rats PCNA: proliferating cell nuclear antigen. Compared with normoxia group,*＜0.05; compared with hypoxia group,#＜0.05,##＜0.01; compared with normoxia+NaHS group,△＜0.05

圖3 4組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的比較

Figure 3 Comparison of ROS production in pulmonary artery smooth muscle cells between four groups of rats Compared with normoxia group,*＜0.05; compared with hypoxia group,#＜0.05,##＜0.01; compared with normoxia＋NaHS group,△＜0.05

圖4 4組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1表達(dá)的比較

Figure 4 Comparison of Cav-1 expression in pulmonary artery smooth muscle cells between four groups of rats Cav-1: caveolin-1. Compared with normoxia group,*＜0.05; compared with hypoxia group,#＜0.05,##＜0.01; compared with normoxia+NaHS group,△＜0.05

低氧性肺動脈壓力持續(xù)性升高的另一個主要原因是肺血管收縮[11,12]。近年來研究表明慢性低氧時過度生成的ROS與肺血管收縮和肺血管重構(gòu)均有關(guān)聯(lián)。ROS是肺血管系統(tǒng)內(nèi)一種重要的信號傳導(dǎo)分子。ROS過度生成可調(diào)節(jié)血管舒張因子的表達(dá)[13,14]，刺激肺動脈平滑肌收縮，在慢性低氧性肺病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，給予NaHS可有效抑制低氧性肺動脈高壓大鼠ROS生成，表明NaHS可能通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解肺血管收縮和重構(gòu)。

目前僅有一篇關(guān)于H2S與Cav-1的研究[15]，該研究報道H2S并不影響大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的Cav-1表達(dá)。但是H2S對于其他疾病細(xì)胞的Cav-1表達(dá)尚不清楚。Cav-1、2、3是組成細(xì)胞質(zhì)膜微囊的主要蛋白質(zhì)成分，是其標(biāo)志性蛋白。它們富含于多種類型的細(xì)胞內(nèi)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。膜受體可與Cav-1結(jié)合對細(xì)胞內(nèi)信號途徑發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[16]。野百合堿（monocrotaline）可減少肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞表面Cav-1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[17]，但我們新近研究結(jié)果表明低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的Cav-1的表達(dá)顯著降低[6]。為了明確Cav-1的表達(dá)是否受NaHS影響，我們用NaHS刺激正常氧濃度和低氧狀態(tài)下平滑肌細(xì)胞Cav-1的表達(dá)，結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)NaHS可上調(diào)平滑肌細(xì)胞Cav-1的表達(dá)的情況，但是不影響正常狀態(tài)下平滑肌細(xì)胞膜Cav-1的表達(dá)，這提示NaHS可能通過影響Cav-1調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用。

綜上所述，本研究證實(shí)NaHS參與低氧性肺動脈高壓肺血管重構(gòu)可能是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞Cav-1的表達(dá)，減少細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的。Cav-1作為保護(hù)性因子參與低氧性肺動脈高壓肺血管重構(gòu)的病理生理學(xué)過程。NaHS作為H2S的隨時供體，畢竟不同于H2S，因此接下來我們將進(jìn)一步深入探討H2S對Cav-1上游和下游信號通路的具體作用機(jī)制，這將對我們重新認(rèn)識低氧性肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制、尋找一條新的預(yù)防和治療途徑具有重要意義。

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（編輯: 周宇紅）

Effect of hydrogen sulfide donor on caveolin-1 expression in pulmonary artery smooth muscle cells from hypoxic rats

YUAN Ping1, WANG Li-Li2, WANG Lan1, ZHAO Qin-Hua1, JIANG Rong1, GONG Su-Gang1, LIU Jin-Ming1*

(1Department of Pulmonary Circulation, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University, Shanghai 200433, China;2Clinical Laboratory, Zhejiang Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hangzhou 310003, China)

To determine the effect of hydrogen sulfide donor, sodium hydrosulfide (NaHS), on caveolin-1 (Cav-1) expression in pulmonary artery smooth muscle cells from hypoxic rats.The chronic hypoxic rat model was established by intermittent normobaric hypoxia exposure. The hypoxic rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) were cultured under mixed gas conditions. Thirty-two Sprague-Dawley (SD) rats were randomly and equally divided into four groups (normoxia group, hypoxia group, normoxia＋NaHS group and hypoxia＋NaHS group). The pulmonary arteriole intima-media thickness, muscularization and PASMCs proliferation was measured by immunohistochemical assay. Reactive oxygen species (ROS) was assessed by fluorescent probe assays. Western blotting was used to detect the protein expression of Cav-1.Compared with control rats, right ventricular systolic pressure (RVSP), right ventricular mass index (RVMI), medial wall thickness, fully muscularized vessels and proliferation of PASMCs were significantly enhanced in response to hypoxia. The level of ROS was significantly higher and the expression of Cav-1 was decreased in the PASMCs of hypoxia group than in control groups. NaHS treatment resulted in improvement of pulmonary arterial blood flow, alleviation of medial wall thickness, inhibition of PASMCs proliferation, decrease of ROS production, and enhancement of Cav-1 protein expression.NaHS treatment alleviates pulmonary vascular structural remodeling in chronic hypoxic rats by decreasing ROS production, up-regulating the expression of Cav-1, and inhibiting PASMCs proliferation.

rats; hypoxia; pulmonary artery; myocytes, smooth muscle; sodium hydrosulfide; caveolin-1; proliferation

(15ZR1434400) and(20144Y0196).

R33l

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.12.212

2015?09?01;

2015?09?30

上海市自然科學(xué)基金（15ZR1434400）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（20144Y0196）

王麗麗，為共同第一作者

劉錦銘，E-mail: jinmingliu2007@163.com