張 杰

病原真菌中非核糖體肽合成酶的產(chǎn)物由5～10個苯環(huán)或開環(huán)連接而成的環(huán)狀四肽所構(gòu)成的毒素類物質(zhì)[1,2].非核糖體肽合成酶由腺苷?；Y(jié)構(gòu)域、巰基化結(jié)構(gòu)域和縮合結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成的模塊組成[3],在藍(lán)綠藻和絲狀真菌中產(chǎn)生的毒素具有宿主特異性[4-6].非核糖體肽是微生物代謝產(chǎn)物的衍生物[5],在植物、昆蟲和哺乳動物中非核糖體肽是組蛋白脫乙?；?HDACs)的抑制因子之一,然而,病原菌侵染宿主時抑制宿主HDACs致病和生物合成的機(jī)制目前尚不清楚[7],但有報道認(rèn)為其為莽草酸途徑的分支[8].

利用生物信息學(xué)技術(shù)對綠僵菌非核糖體肽合成酶的進(jìn)化 、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域及物理化學(xué)性質(zhì)分析,可以為綠僵菌非核糖體肽合成酶生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中的綠僵菌基因組數(shù)據(jù)為材料.

1.2 方法

1.2.1 序列的查找

通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索非核糖體肽合成酶的蛋白質(zhì)序列,再通過綠僵菌數(shù)據(jù)庫NCBI/BLAST/tblastn搜索綠僵菌的核酸序列,進(jìn)而獲得非核糖體肽合成酶基因的全長序列.

1.2.2 序列的生物信息學(xué)分析

用DNAman軟件對非核糖體肽合成酶蛋白序列運(yùn)行clustal W,對親水性、疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;應(yīng)用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;用The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench和COILS on line分析二級結(jié)構(gòu);用NCBI blastp在線分析可能的結(jié)構(gòu)域;用swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)數(shù)據(jù)庫在線建模和三級結(jié)構(gòu)分析[9];用SignalP 4.1 Server預(yù)測蛋白質(zhì)序列的信號肽剪切位點;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測用在線SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/);利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析其所在的信號通路;利用ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測分析其物理和化學(xué)性質(zhì).

2 結(jié)果與分析

2.1 非核糖體肽合成酶一級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

在一級結(jié)構(gòu)上對非核糖體肽合成酶(綠僵菌毒素合成酶、羅氏綠僵菌毒素合成酶、蛹蟲草毒素合成酶、白僵菌毒素合成酶、麗蠅蛹集金小蜂毒素合成酶、牡蠣毒素合成酶、深裂眶鋸雀鯛毒素合成酶、女王燕尾毒素合成酶和牛目樸麗魚毒素合成酶)的氨基酸序列運(yùn)行clustal W和MEGA5.0軟件.由圖1A可知綠僵菌非核糖體肽合成酶在一級結(jié)構(gòu)上保守性極低,在不同的病原菌中只有一個共同的甘氨酸位點 (黑色、灰色和淺灰色域分別表示相同性高于90%,75%和50%).由圖1B可知綠僵菌的非核糖體肽合成酶與冬蟲夏草和半知菌類的蟲生真菌(白僵菌)的毒素合成酶具有較高親緣性,其次是昆蟲類毒素合成酶,而與水生動物類的毒素合成酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn).通過在線比對預(yù)測到該基因編碼的蛋白具有酰基激活酶、乙酰輔酶A綁定位點、腺苷一磷酸綁定位點,見圖1C.

圖1 (A)?；舅睾铣擅付嘈蛄斜葘?(B)非核糖體肽合成酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹,(C)綠僵菌非核糖體肽合成酶的結(jié)構(gòu)域

2.2 非核糖體肽合成酶二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上用COILS在線分析了非核糖體肽合成酶的二級結(jié)構(gòu)(見圖2).由圖2可知:非核糖體肽合成酶有15個α螺旋結(jié)構(gòu),在蛋白質(zhì)中的含量為34.6%;9個β折疊,其含量為19%;無規(guī)則卷曲最多,其含量為46.4%.

圖2 非核糖體肽合成酶的二級結(jié)構(gòu)圖

2.3 非核糖體肽合成酶親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和下游產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測

由圖3A可知非核糖體肽合成酶最高親水性分值為2.30,而最低分值為-2.12;由圖3B可知非核糖體肽合成酶疏水性不顯著,其疏水性最高分值為4.20,最低值為-3.01,總體親水性為0.002(定義為序列中所有氨基酸親水值的總和與氨基酸數(shù)量的比值,負(fù)值越大表示親水性越好,正值越大表示疏水性越強(qiáng)),推測其可能是非水溶性蛋白.由圖3C可知非核糖體肽合成酶具有三次跨膜結(jié)構(gòu).圖3D是預(yù)測到的非核糖體肽合成酶合成物的分子結(jié)構(gòu),其由三個苯環(huán)構(gòu)成.用SignalP 4.1 Server對其一級結(jié)構(gòu)上的信號肽進(jìn)行預(yù)測,由圖3E可知該蛋白質(zhì)無信號肽剪切位點.

2.4 非核糖體肽合成酶三維建模

由圖4A和4B可知在SWISS-MODE數(shù)據(jù)庫中搜索到了50個非核糖體肽合成酶的模板,其中4gr5.1.A模板與靶蛋白的相似性評估得分為26.32%,正常的QMEAN4分值為-4.52,靶蛋白與模型氨基酸的對應(yīng)序列如圖4C所示,其中第484位氨基酸可能由Val突變?yōu)镮Le.蛋白建模序列的覆蓋度如圖4E所示,最有益建模的區(qū)域在Psi值-60度至180度區(qū)域,不可接受區(qū)域為0度,該結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與上述預(yù)測結(jié)果相一致.

圖3 (A)非核糖體肽合成酶親水性分析,(B)非核糖體肽合成酶疏水性分析,(C)非核糖體肽合成酶跨膜結(jié)構(gòu)分析,(D)非核糖體肽合成酶合成產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu),(E)信號肽預(yù)測圖

圖4 (A)非核糖體肽合成酶三維結(jié)構(gòu),(B)非核糖體肽合成酶三維建模,(C)非核糖體肽合成酶三維建模序列,(D)非核糖體肽合成酶可變氨基酸,(E)非核糖體肽合成酶三維建模評分

2.5 非核糖體肽合成酶抗原性片段、物理和化學(xué)性質(zhì)分析

用DNAman軟件預(yù)測到該非核糖體肽合成酶含有24個抗原肽段,其分值和長度(下劃線字母表示最大分值位點)分別如下:

[1]分值=1.266,長度=20,277-TNIVLVLIPVSFVLQSVGLS-296.[2]分值=1.210,長度=36,42RYLSLSHNCCDWVVFSVIPTGVPYAMKVLSRLLKLQ-77.[3]分值=1.167,長度=13,25-LGGVAPFLALLGE-37.[4]分值=1.155,長度=12,321-RKEVPPEFVLRL-332.[5]分值=1.150,長度=9,227-AKVVWVQRQ-235.[6]分值=1.149,長度=16,299-HWAVQTWQFIALVFMF-314.[7]分值=1.149,長度=10,356-DKAVHVIEHD-365.[8]分值=1.148,長度=21,195-FKRSLSLLYTAKSLTLPLKVR-215.[9]分值=1.134,長度=11,395-VDDVTAVVNKI-405.[10]分值=1.124,長度=10,265-ALSHHWCFES-274.[11]分值=1.119,長度=9,379-TVQKIVANT-387.[12]分值=1.114,長度=9,341-IQGILAGSP-349.[13]分值=1.111,長度=15,93-EKDLLSTCSKEICEI-107.[14]分值=1.107,長度=8,186-PNLLLNLT-193.[15]分值=1.104,長度=8,253-EAEVLSAH-260.[16]分值=1.103,長度=10,140-PPELLPSKIA-149.[17]分值=1.086,長度=8,127-IREYIYLP-134.[18]分值=1.082,長度=8,407-GGPSLLDE-414.[19]分值=1.070,長度=8,244-EAYILAKN-251.[20]分值=1.068,長度=6,171-PIGLGS-176.[21]分值=1.049,長度=7,113-VERVEKT-119.[22]分值=1.045,長度=6,162-PWLQPS-167.[23]分值=1.031,長度=6,13-SPSLTP-18.[24]分值=1.028,長度=7,85-YTSYRKA-91.

其物理化學(xué)性質(zhì)用ProtParam在線預(yù)測得知該蛋白質(zhì)的等電點為4.82,分子量為34 119.1 D,40個負(fù)電荷殘基(Asp+Glu),26個正電荷殘基(Arg+Lys),分子式為C1520H2424N404O461S12.假定所有的半胱氨酸形成二硫鍵,其在水中280 nm的消光系數(shù)為29 700 M-1cm1.其氮端的起始氨基酸為Met,預(yù)測到該蛋白質(zhì)在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中,離體狀態(tài)下的半衰期為30小時;在酵母活體中的半衰期為大于20小時;在細(xì)菌活體中的半衰期大于10小時.其不穩(wěn)定性指數(shù)為30.19,屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì).其脂肪族指數(shù)為103.11.

3 討論

利用生物信息學(xué)的方法對研究的目的基因進(jìn)行正確的分析是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的有效途徑之一.微生物的毒素類物質(zhì)的研究起始于50年前[10],但是沒有一種微生物具有全部毒素種類,而只是含有其中的一種毒素或類似物.非核糖體肽合成酶的同源序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果與Brosch G等的報道相一致[11],說明了生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果是可靠的.同時用本地軟件與在線對信號肽段預(yù)測結(jié)果相一致,說明在生物信息學(xué)分析中用多種軟件互相印證結(jié)果的可靠性是必要的.非核糖體肽合成酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與Stachelhaus T等報道的合成抗生素的酶類結(jié)構(gòu)相一致[12].非核糖體肽合成酶的物理化學(xué)性質(zhì)及抗原片段尚未見報道.總體來說,綠僵菌非核糖體肽合成酶結(jié)構(gòu)及功能和微生物分泌的抗生素及類似物的合成酶類相似,其與植物病原菌分泌的毒素因子的異同尚需實驗進(jìn)一步證明,其物理化學(xué)性質(zhì)也需進(jìn)一步地驗證.生物信息學(xué)與其他生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合是生物學(xué)研究的首要途徑之一.

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