佟世生，王 麗，靳靜言，崔忠義，劉 萍，*

（1.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

酶解偶聯(lián)發(fā)酵體外模擬麝香貓咖啡的電子舌相關(guān)性分析

佟世生1，王 麗2，靳靜言2，崔忠義2，劉 萍2，*

（1.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

使用電子舌檢測(cè)，對(duì)發(fā)酵處理和酶解偶聯(lián)發(fā)酵處理的云南小粒咖啡鮮果和生豆進(jìn)行檢測(cè)，將其與天然麝香貓咖啡和其他不同加工方式和產(chǎn)地的咖啡豆進(jìn)行主成分分析和聚類分析，酶解偶聯(lián)發(fā)酵咖啡鮮果所得模擬豆（MX模擬豆）與天然麝香貓咖啡豆的相似性最高，說(shuō)明通過(guò)酶解偶聯(lián)發(fā)酵咖啡鮮果可以得到與天然麝香貓咖啡風(fēng)味相同的咖啡豆，為人工生產(chǎn)麝香貓咖啡豆提供了新思路。

咖啡發(fā)酵，電子舌，主成分分析法，云南小?？Х龋晗阖埧Х?/p>

麝香貓咖啡（Civet coffee），是咖啡鮮果被麝香貓（Civet）吃下，經(jīng)過(guò)消化道消化后排泄出的咖啡生豆，具有特殊風(fēng)味，但產(chǎn)量極低。Massimo[1]對(duì)天然麝香貓咖啡進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它們與未經(jīng)麝香貓吞食的咖啡豆相比質(zhì)地更堅(jiān)硬且易碎，這表明麝香貓胃液滲透到了咖啡豆內(nèi)部，胃蛋白酶或胰蛋白酶類蛋白酶可能通過(guò)內(nèi)果皮對(duì)內(nèi)部易感蛋白進(jìn)行水解以改變咖啡烘焙后感官品質(zhì)。Martinez等[2]利用阿拉比卡咖啡模擬麝香貓咖啡時(shí)，使用鹽酸將消化環(huán)境調(diào)為1.5～2之間，并使用豬胃粘膜的胃蛋白酶（每克蛋白粉包含1000個(gè)胃蛋白酶單位）進(jìn)行酶解處理。Mun[3]的研究發(fā)現(xiàn)蘇門答臘麝香貓咖啡雖然與水洗咖啡香氣組成相似，但麝香貓咖啡的香氣組成更均衡。這說(shuō)明微生物發(fā)酵在麝香貓咖啡品質(zhì)形成中具有重要作用。目前關(guān)于麝香貓腸道內(nèi)哪種微生物發(fā)酵使咖啡風(fēng)味提高未見(jiàn)報(bào)道。Evangelista等[4]的研究中指出使用酵母菌對(duì)干法加工的咖啡豆進(jìn)行發(fā)酵處理，可以顯著地提高其飲用品質(zhì)。但少有研究關(guān)注于采用酶解偶聯(lián)純種發(fā)酵以獲得與麝香貓咖啡品質(zhì)相似的咖啡生豆。

目前，使用現(xiàn)代分析儀器對(duì)咖啡的香氣及感官品質(zhì)進(jìn)行分析的研究日益增加。Ongo等[5]的研究表明電子鼻和氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）能夠有效地區(qū)分四個(gè)產(chǎn)區(qū)的麝香貓咖啡及其普通咖啡，Várv?lgyi等[6]研究發(fā)現(xiàn)在咖啡的感官評(píng)價(jià)中相比于SPME-GCMS，電子舌具有更好的辨識(shí)和區(qū)分能力，可見(jiàn)在咖啡得香氣和感官品質(zhì)評(píng)價(jià)中，現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)已日臻完善，可以與傳統(tǒng)的感官評(píng)價(jià)技術(shù)相結(jié)合，使咖啡的感官評(píng)價(jià)更加準(zhǔn)確。

目前國(guó)外多采用酶解的方式進(jìn)行體外模擬麝香貓咖啡的研究，本研究在確定了酶解的基礎(chǔ)上，使用從咖啡中篩選的能夠提高咖啡風(fēng)味的菌株，進(jìn)行酶解偶聯(lián)發(fā)酵，在確定了最佳處理?xiàng)l件后，對(duì)純種發(fā)酵咖啡生豆和鮮果，酶解偶聯(lián)發(fā)酵云南小?？Х壬购王r果，以及不同加工工藝及產(chǎn)地的烘焙咖啡浸提液進(jìn)行電子舌檢測(cè)，通過(guò)主成分分析和聚類分析對(duì)體外模擬所得麝香貓咖啡豆與其他咖啡豆的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡生豆 2013年10月產(chǎn)自云南保山地區(qū)的發(fā)酵云南小粒（卡提姆）生豆；咖啡鮮果 2013年11月產(chǎn)自云南保山地區(qū)的發(fā)酵云南小粒（卡提姆）鮮果；所有成品咖啡生豆 英皇咖啡；胃蛋白酶 分析純，購(gòu)于淮安百麥綠色生物能源有限公司；鹽酸、氯化鈉、谷氨酸鈉等 分析純，購(gòu)于北京化工廠；發(fā)酵菌株菌3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，篩選自黃金曼特寧；咖啡液體培養(yǎng)基 稱取一定量云南小?？Х壬?，用粉碎機(jī)充分粉碎后按1∶25比例量取蒸餾水，打漿混勻后過(guò)60目篩，將濾液置于121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15 min得到咖啡液體培養(yǎng)基；發(fā)酵種子液 發(fā)酵菌種接入咖啡液體培養(yǎng)基后于37℃條件下發(fā)酵14 h。

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-C型恒溫水浴鍋 北京中科星宇商貿(mào)有限公司；GENECAFé CBR-101咖啡烘焙機(jī) Genesis Co.，Ltd；TSK-1171型滴漏式咖啡機(jī) 燦坤實(shí)業(yè)有限公司；TDL-40C型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TFG-G型通風(fēng)櫥 廣州佳鎂鏵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LX-C50L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；ASTREE電子舌（液體自動(dòng)進(jìn)樣器、電化學(xué)傳感器陣列、電子舌主機(jī)、80 mL標(biāo)準(zhǔn)燒杯） 法國(guó)ALPHAMOS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵生豆和發(fā)酵鮮果的制作 稱取20 g云南小?？Х壬怪糜?號(hào)自封袋中，按5%接種量將準(zhǔn)備好的菌3液體培養(yǎng)液接入自封袋中生豆上，按袋中液體總量占生豆重量70%比例補(bǔ)足無(wú)菌水，倒入3號(hào)自封袋中，混勻密封后將自封袋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 h。發(fā)酵結(jié)束后用無(wú)菌水迅速?zèng)_洗干凈，置于50℃烘箱中進(jìn)行干燥，待其恒重后取出即得發(fā)酵生豆咖啡豆（FS）。

稱取50 g剝?nèi)ネ夤さ脑颇闲×？Х弱r果置于4號(hào)自封袋中，按5%接種量將準(zhǔn)備好的菌3液體培養(yǎng)液接入自封袋中鮮果上，按袋中液體總量占鮮果20%的比例補(bǔ)足無(wú)菌水，倒入4號(hào)自封袋中，混勻密封后將自封袋置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 h，發(fā)酵溫度為37℃。發(fā)酵結(jié)束后用無(wú)菌水迅速?zèng)_洗干凈，置于50℃烘箱中進(jìn)行干燥，待其恒重后取出，將鮮果外殼剝?nèi)ゼ吹冒l(fā)酵鮮果咖啡豆（FX）。

1.2.2 酶解偶聯(lián)發(fā)酵生豆和酶解偶聯(lián)發(fā)酵鮮果的制作 稱取20 g云南小?？Х壬怪糜?號(hào)自封袋中，添加胃蛋白酶1.5%，酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為55℃，酶解完成后進(jìn)行發(fā)酵，菌3接種量5%，外源添加蔗糖1.0%，發(fā)酵時(shí)間2 h，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵結(jié)束后用無(wú)菌水迅速?zèng)_洗干凈，置于50℃烘箱中進(jìn)行干燥，待其恒重后取出即得酶解偶聯(lián)發(fā)酵生豆（MS）。

稱取50 g云南小?？Х弱r果置于4號(hào)自封袋中，添加胃蛋白酶1.5%，酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為55℃，酶解完成后進(jìn)行發(fā)酵，菌3接種量1%，外源添加大豆蛋白胨4%，發(fā)酵時(shí)間4 h，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵結(jié)束后用無(wú)菌水迅速?zèng)_洗干凈，置于50℃烘箱中進(jìn)行干燥，待其恒重后取出即得酶解偶聯(lián)發(fā)酵鮮果（MX）。

1.2.3 咖啡的烘焙及研磨工藝 準(zhǔn)確稱取100 g咖啡豆進(jìn)行烘焙，初始溫度150℃，之后以5℃/min的速度進(jìn)行梯度升溫到250℃后，恒溫烘焙5 min。烘焙結(jié)束后按中等粒度粉碎備用。

1.2.4 電子舌待測(cè)樣品的制備 準(zhǔn)確稱取各種粉碎完成的烘焙咖啡樣品30 g，按固液比1∶10，90℃浸提10 min制備300 mL的烘焙咖啡浸提液。待浸提液冷卻至室溫后進(jìn)行測(cè)量，每次測(cè)量取樣品80 mL，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 電子舌測(cè)定咖啡樣品種類Table 1 Coffee species for measurement of electronic tongue

1.2.5 電子舌預(yù)處理 測(cè)樣前使用0.01 mol/L的HCl、NaCl和MSG對(duì)傳感器進(jìn)行活化，活化時(shí)間1.5 h；檢測(cè)時(shí)間120 s；樣品攪拌速率1 r/s。在烘焙咖啡樣品分析序列設(shè)置時(shí)，對(duì)咖啡浸提液0 h樣品設(shè)置10次重復(fù)測(cè)量，目的是使傳感器適應(yīng)樣品特征，達(dá)到對(duì)咖啡浸提液樣品響應(yīng)的穩(wěn)定狀態(tài)，其后樣品設(shè)置3次重復(fù)。1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行整理，使用SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 云南小?？Х壬购头前l(fā)酵型咖啡豆、發(fā)酵型咖啡豆的電子舌相關(guān)性分析研究

通過(guò)電子舌7個(gè)傳感器的信息收集，運(yùn)用主成分分析法得到未發(fā)酵云南小?？Х壬古c非發(fā)酵型咖啡豆、發(fā)酵型咖啡豆的差異結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為83.539%、7.463%，累計(jì)貢獻(xiàn)率91.002%。所以取前2個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征向量所決定的兩維子空間就能夠充分保存原始數(shù)據(jù)的信息。2號(hào)云南小粒（卡提姆）與發(fā)酵型5號(hào)哥倫比亞、7號(hào)黃金曼特寧在第一主成分范圍內(nèi)相距較遠(yuǎn)。9號(hào)蘇門答臘曼特寧與4號(hào)云南波邦在第一主成分范圍內(nèi)相距較近，在第二主成分范圍內(nèi)距離較遠(yuǎn)。在非發(fā)酵咖啡豆區(qū)域內(nèi)，2號(hào)云南小粒（卡提姆）與1號(hào)云南鐵皮卡、3號(hào)云南AA、4號(hào)云南波邦等非發(fā)酵型咖啡豆能夠很好區(qū)分開(kāi)來(lái)，可以看出在分析咖啡豆是否為發(fā)酵型咖啡豆時(shí)電子舌檢測(cè)具有一定的準(zhǔn)確性，能夠有效地區(qū)分不同產(chǎn)地和加工方式的咖啡豆。

圖1 未發(fā)酵云南小粒咖啡生豆與其他非發(fā)酵咖啡豆的電子舌主成分分析圖Fig.1 Main components analysis of different roasted coffee brew between Yunnan beans and other unfermented beans

圖2 未發(fā)酵云南小?？Х壬古c其他非發(fā)酵咖啡豆的電子舌聚類分析圖Fig.2 Clustering analysis of different roasted coffee brew between Yunnan beans and other unfermented beans

圖2為利用電子舌檢測(cè)和區(qū)分云南小?？Х扰c非發(fā)酵型咖啡、發(fā)酵型咖啡浸提液的聚類分析圖。通過(guò)對(duì)電子舌數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，能夠體現(xiàn)不同咖啡浸提液的風(fēng)味主成分的相似性和差異性，能夠直觀的表現(xiàn)出不同種類咖啡豆的風(fēng)味差異，從圖2中可以看出，發(fā)酵型咖啡豆哥倫比亞與黃金曼特寧在1個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類，云南波邦與前兩者距離為2個(gè)平均單位。云南AA與前三者距離為2個(gè)平均單位。云南鐵皮卡與云南小粒（卡提姆）在8個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類，云南小粒（卡提姆）與哥倫比亞、黃金曼特寧距離最遠(yuǎn)，為25個(gè)平均單位。

2.2 發(fā)酵后云南小?？Х榷古c非發(fā)酵型咖啡豆、發(fā)酵型咖啡豆的電子舌相關(guān)性分析研究

運(yùn)用主成分分析得到發(fā)酵生豆（FS）與其他發(fā)酵類型咖啡豆的差異結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，14號(hào)發(fā)酵生豆（FS）與2號(hào)未發(fā)酵云南小粒（卡提姆）在第一主成分范圍內(nèi)距離較遠(yuǎn)，與5號(hào)哥倫比亞、7號(hào)黃金曼特寧、8號(hào)林東曼特寧距離較近，同處于發(fā)酵型咖啡豆區(qū)域內(nèi)。7號(hào)黃金曼特寧咖啡豆與8號(hào)林東曼特寧咖啡豆距離較近，說(shuō)明兩者飲用品質(zhì)較相似。12號(hào)巴西米納斯與13號(hào)巴西EURO重合區(qū)域較大，且兩者與14號(hào)的距離在第一主成分范圍內(nèi)較近，在第二主成分范圍內(nèi)較遠(yuǎn)。14號(hào)發(fā)酵生豆（FS）與其他發(fā)酵型咖啡豆能夠很好區(qū)分開(kāi)來(lái)，但位置仍處于發(fā)酵豆范圍內(nèi)，和未發(fā)酵云南小粒咖啡豆相比更接近高品質(zhì)咖啡豆風(fēng)味品質(zhì)。

圖3 發(fā)酵后云南小?？Х壬古c其他發(fā)酵咖啡豆的電子舌主成分分析圖Fig.3 Main components analysis of different roasted coffee brew between fermented Yunnan beans and other fermented beans

圖4 發(fā)酵云南小?？Х壬梗‵S）與其他發(fā)酵咖啡豆的電子舌聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis of different roasted coffee brew between fermented Yunnan beans（FS）and other fermented beans

利用電子舌檢測(cè)和區(qū)分發(fā)酵型云南小粒咖啡生豆與其他發(fā)酵型咖啡浸提液的聚類分析見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，林東曼特寧、黃金曼特寧和哥倫比亞三者距離最近，為1個(gè)平均單位。發(fā)酵生豆與前三者在3個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類。巴西EURO和巴西米納斯也在1個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類。發(fā)酵型云南小粒（卡提姆）生豆與前兩者在8個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類。未發(fā)酵型云南小粒（卡提姆）生豆與其他所有發(fā)酵型咖啡豆距離最遠(yuǎn)，為25個(gè)平均單位。說(shuō)明通過(guò)對(duì)云南小粒（卡提姆）咖啡生豆進(jìn)行純種發(fā)酵，能夠?qū)⑵滹嬘闷焚|(zhì)提高到接近高品質(zhì)發(fā)酵型咖啡豆水平。

2.3 酶解偶聯(lián)發(fā)酵云南小?？Х榷古c天然麝香貓咖啡的電子舌相似性分析

運(yùn)用主成分分析得到酶解偶聯(lián)發(fā)酵云南小粒咖啡與天然麝香貓咖啡豆的差異結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5中可以看出，胃蛋白酶酶解偶聯(lián)菌3純種發(fā)酵體外模擬的麝香貓咖啡豆與天然麝香貓咖啡豆等樣品的浸提液均聚于一個(gè)區(qū)域內(nèi)，6號(hào)MX與19號(hào)天然麝香貓咖啡的距離在第一主成分和第二主成分范圍內(nèi)均為最近，重合區(qū)域較多。18號(hào)MS模擬豆與19號(hào)天然麝香貓?jiān)诘诙鞒煞址秶鷥?nèi)距離較近，在第一主成分的范圍內(nèi)距離稍遠(yuǎn)。17號(hào)FX與19號(hào)天然麝香貓?jiān)诘谝恢鞒煞址秶鷥?nèi)距離較近，在第二主成分范圍內(nèi)稍遠(yuǎn)。說(shuō)明通過(guò)胃蛋白酶酶解偶聯(lián)純種發(fā)酵模擬麝香貓咖啡能夠有效提高云南小?？Х榷古c天然麝香貓咖啡的相似性，且MX模擬豆接近天然麝香貓咖啡飲用品質(zhì)的程度最高。

圖5 酶解偶聯(lián)發(fā)酵發(fā)酵云南小粒咖啡豆與麝香貓咖啡豆的電子舌主成分分析分析圖Fig.5 Main components analysis between simulated civet coffee and natural civet coffee

圖6 酶解偶聯(lián)發(fā)酵發(fā)酵云南小?？Х壬古c麝香貓咖啡豆的電子舌聚類分析分析圖Fig.6 Clustering analysis between simulated civet coffee and natural civet coffee

利用電子舌檢測(cè)和區(qū)分發(fā)酵云南小粒咖啡與其他發(fā)酵咖啡浸提液的聚類分析見(jiàn)圖6。從圖6中可以看出，MX模擬豆與天然麝香貓咖啡豆在1個(gè)平均單位的時(shí)候聚為一類，MS模擬豆與前兩者在5個(gè)平均單位的時(shí)候聚為一類，未發(fā)酵云南小粒（卡提姆）與其他咖啡豆的距離最遠(yuǎn)，位于25個(gè)平均單位處。聚類分析表明MX模擬咖啡豆與天然麝香貓咖啡豆相似性最高。其他通過(guò)胃蛋白酶酶解偶聯(lián)純種發(fā)酵體外模擬的麝香貓咖啡豆與天然麝香貓咖啡豆的距離均較其他非發(fā)酵型咖啡豆與發(fā)酵型咖啡豆更近。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)電子舌檢測(cè)數(shù)據(jù)的主成分分析和聚類分析，可以看出電子舌能夠較好的區(qū)分不同種類及產(chǎn)地的咖啡豆制作的浸提液，能夠應(yīng)用于咖啡的感官品質(zhì)分析和質(zhì)量檢測(cè)。

將發(fā)酵咖啡生豆（FS）、發(fā)酵咖啡鮮果（FX）、胃蛋白酶酶解偶聯(lián)菌3純種發(fā)酵咖啡生豆（MS）以及胃蛋白酶酶解偶聯(lián)菌3純種發(fā)酵咖啡鮮果（MX）這四種咖啡豆和天然麝香貓咖啡豆的烘焙后浸提液經(jīng)電子舌測(cè)定，通過(guò)主成分分析與聚類分析兩種方法結(jié)合分析，得到未發(fā)酵云南小粒（卡提姆）咖啡豆與發(fā)酵型咖啡豆哥倫比亞、黃金曼特寧咖啡豆的距離最遠(yuǎn)，為25個(gè)平均單位，發(fā)酵型云南小粒（卡提姆）生豆（FS）與發(fā)酵型咖啡豆哥倫比亞、黃金曼特寧、林東曼特寧咖啡豆在3個(gè)平均單位的時(shí)候聚成一類，MX模擬豆與天然麝香貓咖啡豆在1個(gè)平均單位的時(shí)候聚為一類。通過(guò)胃蛋白酶酶解偶聯(lián)純種發(fā)酵咖啡體外模擬的麝香貓咖啡豆與天然麝香貓咖啡豆的距離較其他非發(fā)酵咖啡豆與發(fā)酵型咖啡豆更近。MX模擬豆與天然麝香貓咖啡豆的相似性最高，說(shuō)明通過(guò)酶解偶聯(lián)發(fā)酵咖啡鮮果或是生豆可以得到與天然麝香貓咖啡風(fēng)味相同的咖啡豆，為人工生產(chǎn)麝香貓咖啡豆提供了新思路。

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Correlation analysis of simulation civet coffee by purebred fermentated coupling with pepsin enzymatic pre-hydrolysis in vitro with electronic tongue

TONG Shi-sheng1，WANG Li2，JIN Jing-yan2，CUI Zhong-yi2，LIU Ping2，*
（1.Beijing City University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

In this research，the detection of fermentation and enzyme uncoupling fermentation processing of Yunnan arabica coffee fruit and green bean was carried out by electronic tongue detection.Then the principal component analysis and cluster analysis it was used to analyzing the relationship among the natural civet coffee and other different processing methods and origins of the coffee beans.The result showed that the fermentation and enzyme uncoupling beans（MX simulation beans）and natural civet coffee beans were similar highest，which proved that the fermentation and enzyme uncoupling of coffee fruit could get the same natural civet coffee flavor of coffee beans，and provided a new idea for the production of artificial musk cat coffeebeans.

coffee fermentation；electronic tongue；principal component analysis；coffee arabica in Yunnan province；civet coffee

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0133-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.019

2015－04－14

佟世生（1970-），男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：shishengt@163.com。

*通訊作者：劉萍（1970-），女，博士，副教授，研究方向：生物技術(shù)，發(fā)酵工程，E-mail：liuping@cau.edu.cn。