沈　媛，陸　琳，王曉玉(暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州5063;南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州5055)

赫賽汀誘導子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡并增強其對化療的敏感性*

沈媛1▲，陸琳2▲，王曉玉1△
(1暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510632;2南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510515)

［摘要］目的:研究赫賽汀單獨或聯(lián)合阿霉素(adriamycin，ADR)、順鉑(cisplatin，DDP)及紫杉醇(paclitaxel，PTX)對子宮內膜癌細胞凋亡和化療敏感性的影響，為臨床應用赫賽汀治療子宮內膜癌提供理論依據(jù)。方法: MTT法檢測赫賽汀、ADR、DDP及PTX處理子宮內膜癌Ishikawa細胞的IC(50)。進一步應用1/2 IC(50)量的赫賽汀與各1/2 IC(50)量的ADR、DDP及PTX藥物聯(lián)合，流式細胞術檢測細胞周期與凋亡變化。結果:赫賽汀抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞生長，引起細胞G1期阻滯，誘導細胞凋亡。子宮內膜癌Ishikawa細胞應用赫賽汀、ADR、DDP及PTX 的IC(50)分別為57.12 mg/L、0.572 μmol/L、67.4 μmol/L和719.5 nmol/L，赫賽汀聯(lián)合化療后顯著提高各組化療藥的殺傷效果，誘導細胞凋亡，與單純化療組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論:赫賽汀誘導子宮內膜癌細胞凋亡，并提高子宮內膜癌細胞株對化療的敏感性。

［關鍵詞］赫賽汀;子宮內膜癌;化療敏感性;細胞凋亡

▲并列第1作者

近年來子宮內膜癌發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢，早期患者預后良好，晚期以及復發(fā)性耐藥性患者預后差，術后需行進一步的輔助治療。對晚期和復發(fā)性耐藥性子宮內膜癌患者，術后輔助化療可明顯提高患者的5年生存率。有關化療方案的選擇，聯(lián)合用藥與單藥化療相比，可明顯提高化療有效率。但目前晚期和復發(fā)耐藥性子宮內膜癌的化療缺乏有效的藥物。赫賽汀是一種人源化單克隆抗體，目前已成為治療腫瘤的重要分子靶向藥物，其抗腫瘤作用是通過與腫瘤細胞膜上人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)癌基因高表達產(chǎn)物P185蛋白的結合而實現(xiàn)的［1］。HER-2是一種原癌基因，在調節(jié)腫瘤細胞生長、分化及存活起著重要的作用，與腫瘤的發(fā)生、轉移、預后、治療等密切相關。已有多篇文獻報道HER-2基因在子宮內膜癌組織中的表達，這些研究結果明確顯示子宮內膜癌有HER-2基因過表達［2-3］。目前已有不少研究探討赫賽汀抗瘤譜，但在子宮內膜癌治療上卻鮮有報道。腫瘤的藥物研究發(fā)展方向是尋找特異性更強、療效更顯著、毒副作用更低的藥物，本文旨在探討赫賽汀對子宮內膜癌細胞周期和凋亡變化，及子宮內膜癌細胞對化療敏感性的影響，為其在子宮內膜癌臨床應用中提供理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑和細胞株

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和胎牛血清(杭州四季青公司) ; RPMI-1640培養(yǎng)基和雙氫二氯熒光黃(Gibco) ; MTT(威佳公司) ; TRIzol (Invitrogen) ; Annexin V試劑盒(上海申能博彩公司)。人高分化子宮內膜癌細胞株Ishikawa由中山醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院李小毛教授惠贈，常規(guī)凍存，為超二倍體細胞，雌激素受體(estrogen receptor，ER)α、ERβ及孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達均陽性。Ishikawa細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2方法

2.1PI染色流式細胞術檢測Ishikawa細胞周期取對數(shù)生長期Ishikawa細胞以2.0×108/L濃度接種于96孔板，赫賽汀設定20、40、60、80 nmol/L濃度。在培養(yǎng)24 h后離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜。離心收集細胞，以1 mL的PBS洗細胞1次，加入500 μL PBS含50 μg/L溴化乙錠(PI)，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30。以標準程序用流式細胞儀檢測，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

2.2MTT法檢測赫賽汀聯(lián)合化療藥物處理Ishikawa細胞的活力取對數(shù)生長期Ishikawa細胞以2.0× 108/L濃度接種于96孔板，實驗分5組，無藥物處理的對照組和赫賽汀、ADR、DDP及PTX 4個實驗組，每組化療藥物設定5個濃度，每個濃度設3個復孔。赫賽汀設定20、40、60、80及100 nmol/L濃度，ADR設定0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、0.75 μmol/L及1 μmol/L濃度，DDP設定10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L濃度，PTX設定10、100、500、750和1 000 nmol/L濃度，在培養(yǎng)24、48、72 h后加入四氮唑藍，4 h后離心棄上清，加入150 μL的DMSO溶解，492 nm濾光片檢測吸光度(A)，細胞抑制率(%)=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%，篩選出各藥物的IC50值。實驗進一步將1/2 IC50赫賽汀和1/2 IC50的ADR、DDP及PTX藥物聯(lián)合應用。于培養(yǎng)24、48、72 h后，按上述方法檢測細胞抑制率。

2.3流式細胞術檢測赫賽汀聯(lián)合化療藥物誘導Ishikawa細胞凋亡率和胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平應用1/2的IC50量赫賽汀與各1/2的IC50量的ADR、DDP及PTX藥聯(lián)合處理細胞，培養(yǎng)12 h后收集細胞PBS洗滌2次后，標本等分為2份，其一，PE標記Annexin V檢測細胞凋亡率;其二，雙氫二氯熒光黃染色測定細胞內ROS。

3統(tǒng)計學處理

計量資料的描述用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。以析因設計資料方差分析比較各組化療藥物間瘤細胞殺傷的差異，兩獨立樣本均數(shù)的比較用t檢驗，化療藥物與化療藥聯(lián)合赫賽汀間比較用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1赫賽汀對子宮內膜癌細胞周期的影響

不同濃度赫賽汀抑制子宮內膜癌細胞Ishikawa增殖，引起細胞G1期阻滯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1　赫賽汀誘導細胞G1期阻滯Table 1.Effect of Herceptin on cell cycle in Ishikawa cells (%.Mean±SD.n=6)

2赫賽汀聯(lián)合化療對子宮內膜癌細胞活力的影響

MTT結果顯示，赫賽汀、ADR、DDP及PTX作用子宮內膜癌Ishikawa細胞的IC50分別為57.12 mg/L、0.572 μmol/L、67.4 μmol/L和719.5 nmol/L。赫賽汀(28.56 mg/L)聯(lián)合ADR(0.29 μmol/L)、DDP (34 μmol/L)及PTX (360 nmol/L)應用后，細胞生長抑制率明顯高于單藥應用，見表2。

表2　赫賽汀單藥及聯(lián)合化療對Ishikawa細胞生長的影響Table 2.The effects of Herceptin in combination with chemotherapeutic drug on the growth of Ishikawa cells (Mean±SD.n=6)

3赫賽汀聯(lián)合化療用藥24 h后流式細胞術檢測子宮內膜癌細胞凋亡及細胞內ROS生成

流式檢測赫賽汀單用或聯(lián)合化療24 h后，聯(lián)合用藥組Ishikawa細胞凋亡及ROS水平明顯增加，見表3。

表3　流式細胞儀檢測各組凋亡率和胞內ROS水平Table 3.The apoptosis rate and ROS levels in Ishikawa cells(%.Mean±SD.n=6)

討論

子宮內膜癌是嚴重威脅我國女性健康的生殖道惡性腫瘤之一。對晚期及復發(fā)性患者，中位生存期不足1年，其治療后復發(fā)率為15%～20%［4-5］。子宮內膜癌的化療始于20世紀60年代，隨著新藥的不斷出現(xiàn)和多中心臨床藥物研究，化療在子宮內膜癌的治療中具有越來越重要的價值，尤其對于晚期和復發(fā)性耐藥性子宮內膜癌，復發(fā)耐藥性患者的綜合治療和分子靶向化療在子宮內膜癌治療中的研究日益重要。子宮內膜癌的發(fā)病機制至今尚未闡明，隨著腫瘤生物學研究的深入，人們逐漸了解到惡性腫瘤的形成是一個多步驟、多因素過程，涉及到多個癌基因的活化和抑癌基因功能的紊亂，不僅與細胞增殖和分化異常有關，同時也和細胞凋亡異常密切相關。凋亡異常參與了子宮內膜惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及化療耐藥等諸多環(huán)節(jié)［6-7］。在眾多與子宮內膜癌密切相關的基因中，HER-2基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有密切的關系。人HER-2基因于20世紀80年代發(fā)現(xiàn)，HER-2癌基因是一種促癌基因，又稱為C-erbB-2或neu或HER-2/neu密碼，位于第17號染色體q21帶上，編碼一分子量為185～190 kD細胞膜上的磷脂蛋白，是腫瘤細胞常發(fā)生異常改變的一個基因。其具有酪氨酸激酶活性，結構非常類似于表皮生長因子受體EGFR，二者氨基酸序列有50%的同源性［1-3］。HER-2增強腫瘤細胞的增殖、抑制凋亡、促進腫瘤細胞的遷移;增加腫瘤細胞的侵襲力，破壞機體組織抗侵襲屏障等，其過度表達的腫瘤細胞對普通化療不敏感，但可以和特異性的HER-2單克隆抗體Herceptin結合，加速HER-2蛋白的降解，從而抑制HER-2對腫瘤細胞向惡性表型的轉導。目前研究已證實，HER-2基因在子宮內膜癌表達高于非癌子宮內膜，與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學行為相關［8-10］。

2002年美國FDA批準了一種全新的藥物赫賽汀是一種人源化的針對HER-2受體的單克隆抗體。赫賽汀是第1個用于治療腫瘤的分子靶向藥物，其作用靶點為腫瘤細胞膜上HER-2基因過表達的產(chǎn)物。赫賽汀治療療效與腫瘤組織的HER-2基因表達狀況密切相關，即HER-2基因表達強度越高，效果越好。國內外研究報道，HER-2在子宮內膜癌組織中的過度表達不僅與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移相關，還與化療耐藥、對激素治療不敏感和預后也密切相關［11-12］。赫賽汀開創(chuàng)了腫瘤靶向性治療的新時代，赫賽汀作為腫瘤靶向性治療應用于子宮內膜癌的治療上卻少有研究。本研究應用赫賽汀處理子宮內膜癌Ishikawa細胞發(fā)現(xiàn)，不同藥物濃度赫賽汀抑制細胞生長，引起細胞G1期阻滯，誘導子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡。本實驗結果還表明赫賽汀對化療有增敏作用，當赫賽汀聯(lián)合ADR、DDP及PTX化療藥物作用子宮內膜癌Ishikawa細胞后，癌細胞的凋亡顯著提高。應用1/2 IC50的赫賽汀和化療藥物均未達到28%的生長抑制率，1/2 IC50的赫賽汀聯(lián)合1/2的IC50化療藥物處理細胞顯示，瘤細胞生長抑制率均達到40%以上，證實赫賽汀有化療的增敏作用。腫瘤細胞耐藥性與抗凋亡蛋白表達升高有關，使DNA損傷修復能力增強，對于各種化療藥物的細胞毒作用產(chǎn)生抵抗，也是化療抵抗的機制之一，赫賽汀除抑制HER-2之外還阻斷細胞毒藥物誘導的凋亡，增強化療敏感性。

通過本實驗，我們用赫賽汀體外處理子宮內膜癌Ishikawa細胞株，發(fā)現(xiàn)赫賽汀不但可以誘導細胞凋亡，同時還可以提高化療藥物的敏感性，為子宮內膜癌提供新的治療方法。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Mechanism of Herceptin enhancing apoptosis and improving sensitivity to chemotherapy in Ishikawa cells

SHEN Yuan1，LU Lin2，WANG Xiao-yu1
(1Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China;2Obstetrics＆Gynecology Department，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China.E-mail: twxy@jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of Herceptin in the apoptosis and drug sensitivity of endometrial cancer Ishikawa cells.METHODS: The IC(50)values of Herceptin，adriamycin (ADR)，cisplatin (DDP) and paclitaxel (PTX) for Ishikawa cells were detected by MTT method.Ishikawa cells were treated with single drug and combined chemotherapy for 24 h，the cell cycle and the apoptosis ratio were determined by flow cytometry.RESULTS: The IC(50)values of Herceptin，ADR，DDP and PTX were 57.12 mg/L，0.572 μmol/L，67.4 μmol/L and 719.5 nmol/L，respectively.Herceptin significantly enhanced the cytotoxicity of the chemotherapeutic drugs，and increased apoptosis ratio statistically.CONCLUSION: Herceptin enhances the apoptosis-inducing ability of the chemotherapeutic drugs and improves the chemotherapeutic sensitivity in Ishikawa cells.

［KEY WORDS］Herceptin; Endometrial cancer; Chemotherapeutic sensitivity; Apoptosis

通訊作者△Tel: 020-38688646; E-mail: twxy@jnu.edu.cn

*［基金項目］廣東省科技計劃(No.2013B021800163) ;暨南大學第一臨床醫(yī)學院科研培育專項基金資助項目(No.2014102)

［收稿日期］2015-05-21［修回日期］2015-07-10

［文章編號］1000-4718(2015)09-1568-04

［中圖分類號］R730.23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.006